Ferritin-L和SCCA1作為HBV共受體的研究.pdf

1、病毒受體是位于宿主細(xì)胞表面的分子復(fù)合物，能夠被病毒識別，并幫助病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞。從現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的病毒受體來看，大部分病毒受體是蛋白質(zhì)，還有些是蛋白聚糖、脂類或糖脂，既有單體狀態(tài)也有多聚體的形式存在。由于宿主細(xì)胞表面的病毒受體的存在，使得病毒具有特異性、高親和性等等生物學(xué)特征。病毒受體是引起病毒感染的主要原因，也是影響病毒組織嗜性的重要因素。隨著生命科學(xué)的研究手段的不斷發(fā)展，病毒受體的研究也取得的大量的成就，越來越多的病毒受體被確定。并且

2、人們發(fā)現(xiàn)某些病毒為了能夠進(jìn)一步的快速有效的侵染靶細(xì)胞，常常利用一個(gè)以上的受體。研究這些受體、共受體的特性及其功能，對于從分子水平闡明病毒侵染的機(jī)制，研制有效的藥物、疫苗等都具有重要的意義。
　　 由于沒有便捷的感染模型，乙肝病毒(HBV)受體相關(guān)研究一直進(jìn)展緩慢。雖然有很多相關(guān)的報(bào)道發(fā)現(xiàn)許多能夠與HBV的preS蛋白發(fā)生相互作用的蛋白質(zhì)，但都沒有實(shí)質(zhì)性證據(jù)支持這些蛋白質(zhì)在HBV感染中的具體作用。2001年意大利的一個(gè)研究小組報(bào)道

3、了SCCA1(也稱HBV binding protain，HBV-BP)可以和HBV的表面抗原蛋白preS1(21-47)發(fā)生相互作用。當(dāng)將其轉(zhuǎn)染入HepG2(肝癌細(xì)胞)和CHO(倉鼠卵巢細(xì)胞)細(xì)胞進(jìn)行過表達(dá)后，都能有效地提高細(xì)胞對HBV吸附的能力。不過CHO雖然對HBV的感染能力的提高，與HepG2細(xì)胞相比卻有數(shù)量級的差距。這現(xiàn)象表明HepG2細(xì)胞表面可能存在另外一個(gè)HBV的共受體，并且由于它的存在使得HepG2細(xì)胞在過量表達(dá)SCCA

4、1后擁有了比CHO細(xì)胞更強(qiáng)的吸附和感染HBV的能力。
　　 本博士論文基于SCCA1在CHO和HepG2細(xì)胞中的過表達(dá)所帶來的對HBV的吸附能力上的差異，展開了對潛在的HBV的共受體的尋找。在第一章中，利用細(xì)菌雙雜交方法，分別以HBV的preS和SCCA1為誘餌蛋白，在正常人肝臟的cDNA文庫篩選同時(shí)與preS和SCCA1發(fā)生相互作用的蛋白質(zhì)。以preS為誘餌蛋白，篩選得到了101個(gè)與其發(fā)生相互作用的陽性克??；使用SCCA1為誘

5、餌蛋白，篩選得到了91個(gè)陽性克隆。通過測序并比對這些克隆的序列，我們發(fā)現(xiàn)ferritin light chain(ferritin-L)同時(shí)出現(xiàn)在了這兩組陽性克隆中。因此我們將ferritin-L這個(gè)在細(xì)菌雙雜交系統(tǒng)中能和preS與SCCA1發(fā)生相互作用的蛋白質(zhì)作為生化和細(xì)胞學(xué)研究的對象。
　　 在第二章中，我們利用了生物化學(xué)手段對ferritin-L與preS和SCCA1的相互作用進(jìn)行了進(jìn)一步驗(yàn)證。首先，構(gòu)建了并在大腸桿菌中進(jìn)

6、行表達(dá)preS、ferritin-L和SCCA1的重組蛋白，通過pull down的方法驗(yàn)證了這三者中兩兩之間可以發(fā)生相互作用。其次，在大腸桿菌中表達(dá)了一系列的preS和ferritin-L缺失突變的融合蛋白，通過pull down實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了preS，ferritin-L和SCCA1這三者之間兩兩相互作用的區(qū)域各不相同，這樣就為三者形成共同的復(fù)合物提供了可能性。最后，我們將preS、ferritin-L和SCCA1三者同時(shí)進(jìn)行了pull

7、-down，結(jié)果顯示這三個(gè)蛋白質(zhì)在體外可以形成復(fù)合物。
　　 如果ferritin-L是與SCCA1結(jié)伴的HBV共受體，那么必須滿足促進(jìn)HBV吸附宿主細(xì)胞的條件。在本博士論文的第三章中，在細(xì)胞水平進(jìn)一步驗(yàn)證了preS、ferritin-L和SCCA1三種蛋白質(zhì)之間的相互作用。首先構(gòu)建的ferritin-L和SCCA1與熒光蛋白的融合表達(dá)載體，利用共聚焦顯微鏡觀察到ferritin-L和SCCA1在細(xì)胞中的分布狀況，發(fā)現(xiàn)有相當(dāng)多的

8、重疊，表明在細(xì)胞中完全有可能發(fā)生ferritin-L與SCCA1的聚合。在肝癌細(xì)胞株SMMC-7721(肝癌細(xì)胞)和CHO細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染SCCA1和ferritin-L的表達(dá)質(zhì)粒，發(fā)現(xiàn)共表達(dá)SCCA1和ferritin-L的細(xì)胞對HBV的吸附能力比單獨(dú)表達(dá)SCCA1有了顯著的提高。如果在培養(yǎng)基中加入大腸桿菌表達(dá)的外源ferritin-L，7721細(xì)胞對于HBV的吸附能力有了劑量依賴型的下降。
　　 綜上所述，本博士論文工作利用細(xì)菌