PD-1-PD-L1和ICOS-ICOSL共刺激分子在HBV轉(zhuǎn)基因小鼠急性肝損傷中的動(dòng)態(tài)變化研究.pdf

1、目的：觀察HBV轉(zhuǎn)基因小鼠急性肝損傷過(guò)程中肝臟PD-1、PD-L1、ICOS、ICOSL及血清中IL-4、IL-2、IFN-γ的動(dòng)態(tài)變化情況，初步探討HBV轉(zhuǎn)基因小鼠在急性肝損傷的免疫變化機(jī)制。
　　方法：選取20只健康雄性C57BL/6小鼠作為正常對(duì)照組（A組），20只健康雄性C57BL/6小鼠作為四氯化碳（CCL4）干預(yù)組（B組），20只雄性HBsAg表達(dá)陰性的轉(zhuǎn)基因小鼠為轉(zhuǎn)基因HBsAg陰性CCL4干預(yù)組（C組），20只雄性

2、HBsAg表達(dá)陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因小鼠為轉(zhuǎn)基因HBsAg陽(yáng)性CCL4干預(yù)組（D組），B、C、D組制作急性肝損傷模型，A組按0.5ml?kg-1腹腔注射橄欖油溶液，于0h、24h、48h、72h四個(gè)時(shí)間點(diǎn)取標(biāo)本。B、C、D每組各留5只作為空白對(duì)照，均按0.5ml?kg-1腹腔注射橄欖油溶液，0h處死，其余15只各自隨機(jī)分組，一次性給予0.5ml?kg-1腹腔注射10％CCL4橄欖油溶液，分別于24h、48h、72h每組隨機(jī)挑選5只小鼠，采集標(biāo)本，血

3、清測(cè)定AST、ALT、ALP、TP、ALB、IL-4、IL-2、IFN-γ，同時(shí)取出肝臟，部分標(biāo)本行HE染色及免疫組化，部分用于RT-qPCR方法鑒定肝臟中的PD-1、PD-L1、ICOS、ICOSL的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：1、生化檢測(cè)：24h，B組與A組比較，AST、ALT水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；B組和D組迅速達(dá)到高峰，與 C組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。48h，C組達(dá)到峰值，但B組AST、ALT已

4、經(jīng)慢慢下降，與C組、D組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。2、病理學(xué)觀察：24h，B組與A組比較已有明顯病理改變。B、C、D組均出現(xiàn)廣泛的肝細(xì)胞變性，壞死輕微，肝小葉內(nèi)可有散在的點(diǎn)狀壞死，以胞漿疏松化和氣球樣變最為普遍；48h，C組病變最嚴(yán)重，出現(xiàn)彌漫性的大片壞死；72h，B、C、D組均有片狀壞死及大片的肝細(xì)胞胞漿疏松化及脂肪空泡，小葉內(nèi)及匯管區(qū)有大量淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞為主的炎細(xì)胞浸潤(rùn)，但C組的病變最嚴(yán)重。3、免疫組化：B組48h

5、 ICOS、ICOSL高表達(dá)，72h又表達(dá)了PD-L1；C組PD-1從24h至72h一直持續(xù)高表達(dá)，ICOS24h高表達(dá)，PD-L148h以后持續(xù)高表達(dá)；D組72hPD-1、ICOSL高表達(dá)。4、RT-qPCR：B組ICOS24h至72h一直高表達(dá)，PD-124h高表達(dá)；C組PD-1從24h至72h一直持續(xù)高表達(dá)，ICOS24h高表達(dá)，ICOSL48h高表達(dá)；D組72h ICOSL高表達(dá)。5、CBA：B、C、D組動(dòng)物IL-2在0h D組

6、高表達(dá)，24h C組升高顯著，48hB、C組繼續(xù)升高，而D組迅速下降，與B、C組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。B組IL-248h達(dá)到峰值，72h迅速下降。C組24h開(kāi)始升高，48h達(dá)到峰值，72h迅速下降。B、C、D組動(dòng)物IFN-γ在0h B組高表達(dá)，24h B、D組表達(dá)升高，但C組仍保持高表達(dá)，48h B、C組繼續(xù)升高，而D組迅速下降，72h B、C組均降低，而D組升高與B、C組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。B組IFN-γ表達(dá)

7、在24h開(kāi)始升高，48h達(dá)到峰值，72h迅速下降。C組0h、24h、48h始終高表達(dá)，72h迅速下降。D組48h降低，與0h、24h、72h比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。B、C、D組動(dòng)物IL-4在0h B組與C、D組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，24h三組IL-4表達(dá)均升高，48h B、C組繼續(xù)升高，而D組迅速下降，72h B、C組迅速降低，而D組升高與B、C組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。在B組、C組24h IL-4表達(dá)開(kāi)始升高，48h達(dá)到峰

8、值，72h迅速下降。D組24h IL-4表達(dá)開(kāi)始升高，48h降到最低，72h迅速上升。
　　結(jié)論：HBV轉(zhuǎn)基因小鼠24h即可出現(xiàn)急性肝損傷，尤其是HBsAg表達(dá)陰性的轉(zhuǎn)基因小鼠損傷比陽(yáng)性小鼠更嚴(yán)重。正常小鼠和轉(zhuǎn)基因HBsAg陰性小鼠受到刺激 PD-1、PD-L1、ICOS、ICOSL及血清中 IL-4、IL-2、IFN-γ均升高，發(fā)生強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，而轉(zhuǎn)基因HBsAg陽(yáng)性小鼠組免疫分子一直表達(dá)較低，其可能原因是在受到長(zhǎng)期 HBsA