移植肝“毒性膽汁”形成及導致膽管損傷機制的實驗研究.pdf

1、一、背景 膽道并發(fā)癥嚴重影響肝移植受者的生存及生活質(zhì)量，被公認為肝臟移植的薄弱環(huán)節(jié)(Achilles'heel)。隨著人們對膽道并發(fā)癥認識的深化和外科吻合技術(shù)的提高，由外科技術(shù)原因造成的膽管吻合口并發(fā)癥及引流管相關(guān)性并發(fā)癥的發(fā)病率呈下降的趨勢，而以非外科技術(shù)因素所導致的以移植物膽管樹損害為主要特征的供體膽管并發(fā)癥則成為術(shù)后膽道并發(fā)癥的主要類型，發(fā)生率為2％-19％。以彌漫性或局灶性的移植物膽管樹狹窄、擴張、毀損及管型形成為病理特

2、征的缺血性膽管病變(ITBL)被認為是非外科性移植物膽管樹損害的主要原因。盡管公認冷保存/再灌注損傷(CPRI)是其發(fā)病的主要因素，但具體機制尚不清楚。近年來，疏水性膽鹽在膽道損傷中的作用受到人們的重視。疏水性膽鹽既可以通過“去垢”(detergent)作用干擾生物膜的脂代謝，也可以誘導細胞調(diào)亡，具有很強的細胞毒性。人的膽鹽池95％以上由疏水性膽鹽組成。正常情況下，人類具有一套中和疏水性膽鹽細胞毒性的自我保護機制，如磷脂可以與膽鹽形成微

3、膠粒(micelle)以降低其細胞毒性、膽汁所含的親水性膽鹽可以通過增強細胞膜的穩(wěn)定性來對抗疏水性膽鹽的細胞毒性等等。此外，膽汁主要成分的分泌完全依賴于位于肝細胞毛細膽管面的肝膽膜轉(zhuǎn)運蛋白(HMTs)，HMTs基因表達異常有可能導致膽汁淤積和膽管損傷。已經(jīng)有研究提示肝移植術(shù)后早期存在膽汁成分失衡的現(xiàn)象。綜合近年來國內(nèi)外的研究結(jié)果我們提出了移植肝冷保存/再灌注膽管損傷的“毒性膽汁”假說：在經(jīng)歷CPRI后，移植肝HMTs及相關(guān)調(diào)控因子的表達

4、及功能可能出現(xiàn)改變，導致機體對抗疏水性膽鹽毒性的保護性機制被破壞，形成具有較強細胞毒性的“毒性膽汁”，最終對膽管造成損傷。顯然，如果我們能對該假說加以驗證，必將加深對移植肝膽道并發(fā)癥發(fā)生機制的認識，也有助于拓展新的預防和治療策略。 二、目的 疏水性膽鹽具有很強的細胞毒性，在膽管損傷中扮演著重要角色。本研究擬以驗證“毒性膽汁”假說為主要目的，建立一種適于移植肝膽道問題研究的大鼠肝移植模型，探討經(jīng)歷CPRI后移植肝膽汁主要成

5、分的變化規(guī)律及與膽管損傷的相關(guān)性，并對HMTs及其關(guān)鍵性調(diào)控因子FXR的表達及功能變化進行評估，為臨床上移植肝膽道并發(fā)癥的防治提供新的思路。 三、方法與結(jié)果 1.重建肝動脈血供的大鼠原位肝移植膽道外引流模型的建立與評估：在經(jīng)典的“雙袖套”法的基礎(chǔ)上，將帶肝動脈的供肝主動脈直接與受體腹主動脈行端側(cè)吻合重建肝動脈血供，同時橫斷受體膽總管，行膽道外引流和空腸造瘺，重建膽汁回流通路以維持膽鹽腸肝循環(huán)。手術(shù)成功率85.00％(17

6、/20)，術(shù)后7d動物存活率80.00％(16/20)，術(shù)后14d動物存活率75.00％(15/20)，與對照組無顯著差異(P＞0.05)。行改良術(shù)式后受鼠膽汁γ-GT、ALP水平及膽道并發(fā)癥發(fā)生率均顯著降低，膽汁TBA水平與對照組相似。 2.CPRI對大鼠移植肝膽鹽分泌的影響：建立了專門用于檢測膽汁膽鹽的柱前衍生反相高效液相色譜法(RP-HPLC)，該法具有較高的敏感性和良好的可重復性。大鼠被隨機分為對照組(A組)、供肝冷保存

7、1h組(B組)和供肝冷保存12h組(C組)。在大鼠膽汁中共檢測到11種膽鹽。肝移植術(shù)后B、C組膽汁TCA和TCDCA等疏水性膽鹽濃度明顯上升，而THDCA和TUDCA等親水性膽鹽濃度在術(shù)后頭4d的一過性升高后持續(xù)下降，使得膽鹽的疏水指數(shù)(HI)從術(shù)后第5d起逐漸升高，在術(shù)后10d左右達到高峰。并且HI升高的程度與供肝冷保存時間呈正相關(guān)。 3.移植肝膽汁成分失衡在冷保存/再灌注膽管損傷中的意義：全面分析了肝移植術(shù)后移植肝TBA、T

8、ch、磷脂等主要成分和γ-GT、ALP水平的變化情況，并對膽管上皮細胞凋亡及組織損傷情況進行了評估。結(jié)果顯示，CPRI在術(shù)后早期可以顯著抑制移植肝膽鹽和磷脂的分泌，此后膽鹽分泌恢復的速度明顯高于磷脂分泌恢復的速度，使得在10-14d的時間內(nèi)移植組膽鹽/磷脂持續(xù)高于對照組。直線回歸分析表明術(shù)后膽汁γ-GT和ALP的分泌量與膽鹽的分泌量高度相關(guān)。組織學評估提示高膽管損傷嚴重程度評分(BDISS)組大鼠的膽鹽/磷脂顯著高于低BDISS組。

9、 4.CPRI對移植肝HMTs表達的影響：采用熒光免疫組織化學、熒光實時定量PCR和Westernblotting等技術(shù)從mRNA和蛋白等不同層面評估CPRI對HMTs表達的影響，并利用透射電鏡(TEM)觀察移植肝毛細膽管結(jié)構(gòu)的變化情況。結(jié)果提示毛細膽管是對CPRI高度敏感的結(jié)構(gòu)。移植術(shù)后早期各種HMT的mRNA及蛋白表達均呈現(xiàn)不同程度的下降，但膽鹽轉(zhuǎn)運泵Ntcp和Bsep的表達通常在術(shù)后3-5d內(nèi)即恢復到正常水平，而磷脂轉(zhuǎn)運泵Md

10、r2的表達水平在術(shù)后14d內(nèi)持續(xù)偏低，使得移植組Bsep和Mdr2的mRNA及蛋白表達水平之比在術(shù)后14d內(nèi)明顯高于對照組。 5.CPRI后移植肝FXR表達及功能的變化：采用免疫組織化學、熒光實時定量PCR和Westernblotting等技術(shù)從mRNA及蛋白等不同層面探討移植肝FXR表達的變化規(guī)律，并利用EMSA評估CPRI對FXR轉(zhuǎn)錄活性的影響。結(jié)果顯示，CPRI可以明顯抑制FXR的表達，術(shù)后7dFXRmRNA及蛋白的表達水

11、平最低；EMSA提示經(jīng)歷CPRI后，移植肝FXR∶RXR二聚體與IR-1的結(jié)合能力下降，并且下降的程度與供肝冷保存時間呈正相關(guān)。 四、結(jié)論 1.重建肝動脈血供的大鼠肝移植膽道外引流模型比較符合生理，具有較好的穩(wěn)定性和可靠性，是進行肝移植術(shù)后膽道問題研究的理想動物模型； 2.大鼠移植肝“毒性膽汁”形成可能主要與下列因素有關(guān)：(1)經(jīng)歷CPRI后，膽汁總膽鹽中疏水性膽鹽所占比重增加，導致膽鹽細胞毒性增加；(2)CPR