淮山藥預(yù)處理對大鼠腎臟缺血再灌注損傷保護作用的實驗研究.pdf

1、目的：通過制作SD大鼠腎臟缺血再灌注損傷模型，探討淮山藥灌胃預(yù)處理在預(yù)防和減輕腎臟缺血再灌注損傷和促進腎臟再生修復(fù)方面的作用。 方法： 1．選用60只3～4周齡雄性SD大鼠進行動物實驗。實驗動物造模前2周，所有SD大鼠腹腔內(nèi)注射BrdU 100mg/kg體重，連續(xù)3天，然后隨機分4組。正常對照組(N，n=6)大鼠常規(guī)麻醉后行剖腹手術(shù)，下腔靜脈采血和收獲腎臟標本；假手術(shù)組(SO，n=6)大鼠常規(guī)麻醉后行剖腹手術(shù)，游離雙側(cè)腎

2、蒂血管后不作結(jié)扎，45min后采血和收獲腎臟標本；缺血再灌注淮山藥灌胃預(yù)處理組(I/R淮山藥組，n=24)和缺血再灌注無菌生理鹽水灌胃對照組(I/R 生理鹽水組，n=24)大鼠在常規(guī)麻醉后行剖腹手術(shù)，游離雙側(cè)腎蒂血管后用無損傷動脈夾阻斷雙腎血流45min后，恢復(fù)血流、關(guān)閉腹腔。分別于再灌注2h、12h、24h、48h四個時間點隨機選I/R淮山藥組和FR生理鹽水組各6只大鼠進行下腔靜脈采血和收獲腎臟標本。動物造模前5天：I/R淮山藥組SD

3、大鼠，用淮山藥10g/kg體重灌胃，連續(xù)5天；I/R 生理鹽水組SD大鼠，用無菌生理鹽水作為安慰劑灌胃，連續(xù)5天。 2．各組實驗動物血清標本應(yīng)用全自動生化分析儀測定BUN、Set，了解腎功能；MDA試劑盒TBA法檢測血清MDA值；腎臟標本常規(guī)病理切片，H-E染色觀察腎組織損傷程度；TNNEL法檢測細胞凋亡，免疫組織化學(xué)S-P法檢測細胞增殖情況，并在激光共聚焦顯微鏡下觀察腎內(nèi)BrdU陽性細胞和Pax-2陽性細胞分布情況；RT-PC

4、R檢測HGF、C-met、BMP-7、Pax-2基因表達情況。 主要結(jié)果： 1．腎組織損傷情況：I/R淮山藥組大鼠腎臟缺血45min再灌注12h、24h、48h，組織學(xué)評分值分別為7.50±0.55、6.17±0.75、4.17±0.75，較I/R生理鹽水組(分別為：8.50±0.55、7.00±0.89、5.17±0.98)明顯減低，有顯著性統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。在再灌注12h和24h時，兩組大鼠腎小管損傷最為明

5、顯，其組織學(xué)評分較SO組(0.67+0.52)明顯增高，有顯著性統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)。 2．腎功能情況：N組Scr、BUN水平分別為23.95±3.20μmaol/L、5.79±0.54mmol/L，與SO組(分別為：25.12±3.95μmol/L、6.15±0.40mmol/L)比較，均無明顯差異(P>0.05)：腎臟缺血再灌注損傷后各組Scr、BUN水平均有上升，于再灌注后12h和24h最為明顯；再灌注后2h、12h

6、、24h、48h，I/R淮山藥組Scr值分別為34.23±5.08μmol/L、56.38±8.70μmol/L、81.53±10.17μmol/L、55.01±9.71μmol/L，與同時間點I/R生理鹽水組(46.8±3.69μmol/L、98.70±12.37μmol/L、128.5±17.30μmol/L、80.72±11.13μmaol/L)比較，有明顯降低(P<0.05)；12h、24h、48h，I/R淮山藥組的BUN值分別

7、為15.3±2.60mmol/L、19.56±3.89mmol/L、14.72±2.99mmol/L，與同時間點UR生理鹽水組(22.07±4.57mmol/L、34.75±6.32mmol/L、20.16±2.40mmol/L)比較，有明顯降低(P<0.05)。 3．組織氧化損傷和細胞凋亡情況：SO組大鼠血清MDA水平為3.65+0.98nmol/ml與N組(3.70±0.70nmol/ml)比較，無顯著性統(tǒng)計學(xué)差別(P>0.

8、05)。再灌注2h、12h、24h，I/R淮山藥組大鼠血清MDA值分別為4.74±0.50nmol/ml、6.19±0.68nmol/ml、5.16±0.58nmol/ml，與I/R理鹽水組(7.45±1.03nmol/ml、10.52±1.57nmol/ml、6.93±1.32nmol/ml)比較，峰值明顯降低(P<0.05)。再灌注48h，I/R淮山藥組的血清MDA值為5.05±0.70nmol/ml，與I/R理鹽水組(5.89+1

9、.21nmol/ml)比較，無顯著性統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。腎臟再灌注2h就有凋亡細胞出現(xiàn)，12h時可見大量凋亡細胞脫落到腎小管腔中。再灌注12h時，I/R淮山藥組凋亡細胞數(shù)為10.17±2.14/HP，較I/R生理鹽水組(13.67±2.94/HP)明顯減少，有顯著性統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。 4．細胞增殖和BrdU陽性細胞分布情況：腎缺血再灌注損傷后可見PCNA陽性細胞，且主要位于腎小管。在再灌注后2h、12h、24h

10、、48h，I/R淮山藥組PCNA陽性細胞數(shù)分別為2.67±1.21/HP、9.50±1.87/HP、14.83±2.71/HP、10.83±2.04/HP，較I/R生理鹽水組(1.83±0.75/HP、7.00±1.41/HP、11.33±1.75/HP、8.50±1.05/HP)明顯增多，有顯著性統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。SO組大鼠腎乳頭區(qū)有大量BrdU陽性細胞，很少位于腎小管壁，在再灌注后48h I/R淮山藥組大鼠腎乳頭區(qū)BrdU

11、陽性細胞有較明顯的減少，而腎小管壁可見較多的BrdU陽性細胞；在再灌注后24h，I/R淮山藥組BrdU陽性細胞數(shù)為13.17±3.19/HP，較I/R生理鹽水組(8.33±2.16/HP)和SO組(1.17±0.75/HP)均有明顯增加(P<0.05)。 5.相關(guān)基因表達情況： (1)缺血再灌注損傷后12h、24h，UR淮山藥組大鼠腎臟HGF mRNA相對表達量分別為0.51±0.10、0.46±0.09，與I/R.生

12、理鹽水組(0.36±0.02、0.31±0.15)和SO組(0.28+0.05)相比有上調(diào)(P<0.05)；缺血再灌注損傷后12h、24h I/R淮山藥組大鼠腎臟C-met mRNA相對表達量分別為1.22±0.28、0.46±0.09，與I/R生理鹽水組(0.86±0.08、0.31±0.15)相比有上調(diào)(P<0.05)。 (2)BMP-7 mRNA在腎缺血再灌注損傷后開始的表達是下調(diào)的，于12h時開始上調(diào)，在再灌注損傷24h

13、最為顯著。再灌注后12h，I/R淮山藥組大鼠腎臟BMP-7 mRNA相對表達量為0.6±0.09，與I/R生理鹽水組(0.39±0.08)和SO組(0.42±0.07)相比有明顯上調(diào)(P<0.05)。 (3)Pax-2 mRNA在N組、SO組腎臟組織中均未見明顯表達，腎缺血再灌注損傷12h后，I/R淮山藥組和I/R生理鹽水組大鼠腎臟Pax-2 mRNA開始有表達。同樣在激光共聚焦顯微鏡下觀察，N組、SO組大鼠腎小管壁中均未見Pa

14、x-2陽性細胞；腎缺血再灌注損傷12h時I/R淮山藥組腎小管出現(xiàn)Pax.2陽性細胞，于再灌注后24h時I/R淮山藥組可見Pax-2、BrdU雙陽性標記細胞位于腎小管壁。 主要結(jié)論： 1.缺血再灌注可引起明顯的腎臟組織結(jié)構(gòu)損傷和功能損害，淮山藥灌胃預(yù)處可以減輕氧化損傷和減少細胞凋亡的發(fā)生，降低了血清Scr、BUN和MDA水平，從而有效地保護了腎功能。 2.淮山藥灌胃預(yù)處理，提高了腎組織HGF、C-met和BMP-7