快速老化小鼠SAMP8老化過程中自噬的改變以及mTOR信號通路功能研究.pdf

1、在受累腦區(qū)形成細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)聚集體是許多神經(jīng)退行性疾病的共同特點，如阿爾茨海默?。ˋD），帕金森病(PD)和亨廷頓病，而這些蛋白質(zhì)沉積多由泛素分子連接，提示蛋白質(zhì)降解系統(tǒng)功能障礙。自噬溶酶體系統(tǒng)和泛素蛋白酶體系統(tǒng)（UPS）是大多數(shù)腦細(xì)胞胞漿內(nèi)聚集的或錯誤折疊蛋白的主要降解途徑。UPS選擇性的降解細(xì)胞內(nèi)短壽命的錯誤折疊蛋白。而自噬與之相反，其選擇性較差，有助于降解長壽命的蛋白質(zhì)和受損的細(xì)胞器（如線粒體），甚至某些細(xì)胞外的成分。自噬對保持神經(jīng)

2、元的內(nèi)穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，因其可以清除老化的有聚集傾向的且對細(xì)胞有害的蛋白質(zhì)，并為蛋白質(zhì)的合成提供大分子物質(zhì)。自噬可以分為以下幾個步驟：首先包裹待降解底物形成雙層膜結(jié)構(gòu)，稱為自噬體，之后自噬體與溶酶體結(jié)合形成自噬溶酶體，內(nèi)容物被溶酶體內(nèi)的水解酶降解，最后降解產(chǎn)物進(jìn)入胞漿循環(huán)利用。自噬體和自噬溶酶體統(tǒng)稱為自噬小泡(AVs)，是自噬的主要形態(tài)學(xué)特征。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白激酶(mTOR)是自噬的一個抑制因子，是一個細(xì)胞內(nèi)的保守激酶系統(tǒng)，是能量狀態(tài)

3、、生長因子和營養(yǎng)信號的中心傳感器，其活性可以被某些藥物抑制，如雷帕霉素等。
　　 AD是一種神經(jīng)退行性疾病，主要特點為進(jìn)行性癡呆，形態(tài)學(xué)改變包括腦萎縮、具有β淀粉樣蛋白（Aβ）沉積的老年斑、神經(jīng)元內(nèi)具有tau蛋白異常磷酸化的神經(jīng)元纖維纏結(jié)(NFT)。在AD患者的尸檢標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)腦內(nèi)營養(yǎng)缺乏而腫脹的突起內(nèi)聚集了大量AVs，這表明AD的發(fā)病過程中有自噬系統(tǒng)參與。在散發(fā)性AD和PS1/APP轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)發(fā)病早期自噬被誘導(dǎo)，并不是淀粉樣

4、蛋白沉積引起的后果，而大部分的Aβ在AD患者腦內(nèi)可在溶酶體內(nèi)正常降解。
　　 老化是AD的主要危險因素，因為細(xì)胞和器官由于蛋白質(zhì)和受損細(xì)胞器異常聚積而功能逐漸下降是一個普遍現(xiàn)象。許多證據(jù)顯示，自噬溶酶體系統(tǒng)的增齡性功能障礙可能是衰老過程中異常蛋白質(zhì)聚集的原因。老化過程中自噬功能的下降可以決定細(xì)胞和個體的壽命。誘導(dǎo)神經(jīng)元內(nèi)的自噬，可以使老齡果蠅的壽命延長56％，若抑制自噬，則壽命會縮短，并能觀察到神經(jīng)退行性改變。最近有研究顯示，t

5、au蛋白磷酸化可通過PI3K/mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)行調(diào)節(jié)。在AD患者腦內(nèi)的研究進(jìn)一步證實了mTOR和Tau蛋白之間的聯(lián)系，研究表明mTOR信號在有可能生成NFTs的神經(jīng)元內(nèi)選擇性的增強(qiáng)，并且這種增強(qiáng)與tau蛋白磷酸化相關(guān)。這些證據(jù)表明，在老化過程中mTOR信號的長期增強(qiáng)可以促進(jìn)Tau蛋白的病理變化。有研究已經(jīng)證實，長期給予雷帕霉素或敲除mTOR的靶點p70S6K可以延長小鼠的壽命，可能會起到延緩衰老的作用。
　　 快速老化小鼠

6、（SAMP8）是由日本京都大學(xué)竹田俊男教授由AKR/J小鼠開發(fā)而來，以學(xué)習(xí)記憶功能呈增齡性加速衰退為主要特征，該小鼠成為了研究老化和學(xué)習(xí)記憶障礙的理想哺乳動物模型之一。SAMP8小鼠不但具有一些與老年人相似的特征，如壽命短、駝背、活動減少、毛發(fā)稀少等，還具有神經(jīng)退行性變的特征，如早發(fā)的學(xué)習(xí)記憶障礙、情緒變化、生理節(jié)律異常、腦內(nèi)神經(jīng)元丟失和神經(jīng)遞質(zhì)釋放減少。SAMR1不表現(xiàn)出這些老化特征，一般作為其對照小鼠。值得關(guān)注的是，SAMP8小鼠還

7、具有一些蛋白修飾的改變，如年齡相關(guān)的Tau蛋白異常磷酸化和Aβ沉積，與AD患者腦內(nèi)的變化相似。
　　 到目前為止，還沒有關(guān)于SAMP8小鼠增齡性腦內(nèi)自噬活性改變的研究，以及自噬功能的改變是否與其老化和認(rèn)知功能改變有關(guān)。為了更好的理解老化、自噬以及神經(jīng)退行性變?nèi)咧g的關(guān)系，在本研究中，我們研究了SAMP8小鼠在老化過程中不同腦區(qū)的自噬增齡性改變，并進(jìn)一步研究了mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在SAMP8小鼠老化和神經(jīng)退行性變過程中的作用。<

8、br>　　 1、快速老化小鼠SAMP8體內(nèi)外增齡性神經(jīng)退行性變
　　 目的：研究SAMP8小鼠腦內(nèi)體內(nèi)體外的增齡性的神經(jīng)退行性變，為下一步研究提供理論基礎(chǔ)。
　　 方法：用Morris水迷宮評測2、7和12月齡SAMP8和SAMR1小鼠的學(xué)習(xí)和空間記憶能力。原代神經(jīng)元取自新生SAMP8和SAMR1小鼠的海馬，在培養(yǎng)第10天進(jìn)行免疫熒光染色。利用Western-blot檢測磷酸化Tau蛋白的水平。
　　 結(jié)果：S

9、AMP8和SAMR1小鼠在2月齡時的學(xué)習(xí)和空間記憶能力無明顯差別，與SAMR1小鼠相比，在7(P＜0.05)和12(P＜0.05)月齡時SAMP8小鼠出現(xiàn)明顯的學(xué)習(xí)記憶功能下降。在培養(yǎng)第10天時，SAMP8組神經(jīng)元細(xì)胞狀態(tài)較差，突起較細(xì)且短，部分突起出現(xiàn)斷裂，突起上呈現(xiàn)出“串珠樣”改變。而對照組SAMR1小鼠則細(xì)胞狀態(tài)較好，無此變化。Western-blot結(jié)果顯示，在SAMR1小鼠的海馬和皮質(zhì)區(qū)Tau[pS199]水平在7(P＜0.0

10、5)和12月齡(P＜0.05)均出現(xiàn)了明顯增多。而SAMP8來源的神經(jīng)元在培養(yǎng)10天時Tau[pS199]和Tau[pS396]的水平均較對照組明顯提高。
　　 結(jié)論：SAMP8小鼠表現(xiàn)出年齡相關(guān)的神經(jīng)退行性變特征，如在7和12月齡時表現(xiàn)出學(xué)習(xí)和記憶能力下降，Tau蛋白磷酸化水平增高。與SAMR1小鼠相比，新生SAMP8小鼠來源的原代神經(jīng)元也表現(xiàn)出一定的神經(jīng)退行性改變。以上結(jié)果提示，在本實驗室飼養(yǎng)的SAMP8小鼠能夠穩(wěn)定的表現(xiàn)出

11、認(rèn)知功能下降以及退行性變相關(guān)的神經(jīng)病理學(xué)改變，為下一步研究打下了良好的基礎(chǔ)。
　　 2、快速老化小鼠SAMP8腦內(nèi)年齡相關(guān)的自噬改變
　　 目的：研究SAMP8小鼠腦內(nèi)年齡相關(guān)的自噬改變以及這些改變是否在其老化以及認(rèn)知功能下降過程中發(fā)揮作用。
　　 方法：利用透射電鏡觀察SAMP8和SAMR1小鼠海馬神經(jīng)元的超微結(jié)構(gòu)以及AVs的變化。利用免疫組化以及Western-blot觀察在2、7和12月齡SAMP8和SAM

12、R1小鼠海馬和皮質(zhì)內(nèi)泛素陽性蛋白、LC3以及Beclin1的表達(dá)。
　　 結(jié)果：在海馬的CA3和皮質(zhì)區(qū)，7(P＜0.05)和12月齡(P＜0.05)SAMP8小鼠的泛素陽性蛋白的OD值明顯高于同齡的SAMR1小鼠。在12月齡的SAMP8小鼠的海馬和皮質(zhì)區(qū)泛素陽性蛋白呈現(xiàn)出聚集狀態(tài)。
　　 透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，2月齡的SAMP8和SAMR1小鼠海馬神經(jīng)元內(nèi)線粒體、細(xì)胞核以及其他細(xì)胞器狀態(tài)均正常，很少見到AVs。在7月齡的SA

13、MP8小鼠海馬神經(jīng)元內(nèi)細(xì)胞核出現(xiàn)固縮變形，線粒體輕度腫脹、脊和膜輕度消失，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹，胞漿內(nèi)有少量的密度不勻的致密物，可能為降解的細(xì)胞器或者脂褐素沉積，有些被雙層膜結(jié)構(gòu)包裹，可以觀察到少量的雙層膜的AVs。而與2月齡的SAMR1小鼠相比，7月齡的SAMR1小鼠海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)無明顯變化。12月齡的SAMP8小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞狀態(tài)很差，出現(xiàn)胞漿空泡化，核質(zhì)邊移，細(xì)胞器減少、線粒體數(shù)量減少，線粒體腫脹、脊和膜消失，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒，在胞漿

14、和軸突內(nèi)可見到大量的致密物以及AVs。而12月齡的SAMR1小鼠則變化較輕微，僅有少量致密物沉積，AVs少見。
　　 在海馬CA1和CA3區(qū)免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，與同齡SAMR1小鼠相比，2月齡的SAMP8小鼠的LC3的陽性顆粒較多，但LC3-Ⅱ/β-actin的比值無統(tǒng)計學(xué)意義。在7(P＜0.05)和12月齡(P＜0.05)的SAMP8小鼠海馬CA1和CA3區(qū)免疫組化染色較對照組明顯增強(qiáng)，以CA3區(qū)較明顯，western blot

15、結(jié)果提示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。在皮質(zhì)區(qū)LC3的表達(dá)變化與海馬區(qū)相似，7和12月齡的SAMP8小鼠的表達(dá)明顯增強(qiáng)。與對照組相比，SAMP8小鼠在海馬和皮質(zhì)區(qū)的Beclin1表達(dá)在7月齡明顯增加，12月齡時出現(xiàn)明顯下降。
　　 結(jié)論：SAMP8小鼠的大部分神經(jīng)退行性改變從7月齡開始出現(xiàn)，而自噬活性在7月齡先出現(xiàn)升高，12月齡時出現(xiàn)了明顯下降。隨著快速老化過程的進(jìn)展，自噬活性在12月齡時出現(xiàn)下降，這一變化與AD患者的變化類似，提示從自噬這

16、一角度來說，12月齡SAMP8小鼠的病理學(xué)改變與晚發(fā)性AD更加相似。充分了解SAMP8小鼠自噬活性的增齡性改變有助于進(jìn)行更深入的研究，如治療AD以及抗老化的藥物研究。
　　 3、mTOR信號通路參與SAMP8小鼠老化過程中自噬活性的調(diào)節(jié)
　　 目的：探討mTOR信號通路是否在SAMP8小鼠的神經(jīng)退行性變過程中發(fā)揮作用，給予雷帕霉素是否可改善SAMP8小鼠神經(jīng)退行性變。
　　 方法：原代神經(jīng)元培養(yǎng)同前，在培養(yǎng)第7天

17、時加入0.5或1.0μM雷帕霉素，作用3天后進(jìn)行免疫熒光染色或者Western-blot分析。用Western-blot檢測磷酸化p70S6K、總的mTOR、磷酸化mTOR、Bcl-2以及Tau[pS199]和Tau[pS396]的表達(dá)變化。
　　 結(jié)果：在老齡的SAMP8小鼠海馬區(qū)mTOR(pSer2448)(P＜0.01)和p70S6K(pThr389)(P＜0.01)的水平較對照組明顯提高。
　　 免疫熒光染色結(jié)果

18、顯示，SAMR1來源的神經(jīng)元細(xì)胞狀態(tài)較好，突起平滑且較長。而未處理組的SAMP8來源的神經(jīng)元狀態(tài)較差，大部分突起斷裂，并呈現(xiàn)串珠樣改變。加入0.5μM雷帕霉素狀態(tài)較未處理組好，部分細(xì)胞的突起平滑細(xì)長，但仍有部分神經(jīng)元突起斷裂或沒有突起。加入1.0μM雷帕霉素的SAMP8神經(jīng)元，細(xì)胞狀態(tài)較未處理更差，大部分細(xì)胞沒有突起，部分細(xì)胞已經(jīng)死亡。
　　 SAMP8神經(jīng)元組的Tau[pS199](P＜0.01)和Tau[pS396](P＜0

19、.01)均明顯高于對照SAMR1組，給予0.5μM雷帕霉素預(yù)處理3天后Tau[pS199]（P＜0.05）和Tau[pS396](P＜0.05)都出現(xiàn)降低。加入0.5μM雷帕霉素可以提高SAMP8神經(jīng)元內(nèi)LC3-Ⅱ(P＜0.05)和Beclin1(P＜0.05)的水平，并減少p70S6K(pThr389)(P＜0.05)的水平，對mTOR(pSer2448)(P＞0.05)水平無影響。雷帕霉素可以使神經(jīng)元內(nèi)Bcl-2的水平降低。

20、　　 結(jié)論：mTOR信號通路參與了SAMP8小鼠的神經(jīng)神經(jīng)退行性變的發(fā)生，給予雷帕霉素可以保護(hù)神經(jīng)元，減少Tau蛋白的異常磷酸化。提示雷帕霉素可能可以改善SAMP8小鼠的認(rèn)知功能下降。
　　 綜上所述，SAMP8小鼠在7月齡時開始出現(xiàn)學(xué)習(xí)和和記憶能力下降，Tau蛋白磷酸化增多，此時待降解蛋白增多，自噬小泡增多，自噬活性提高。在12月齡時SAMP8小鼠學(xué)習(xí)和和記憶能力持續(xù)下降，Tau蛋白磷酸化明顯增多，此時細(xì)胞內(nèi)待降解蛋白呈聚集

21、狀態(tài)，在電鏡下可見大量呈團(tuán)塊狀的致密物和自噬小泡聚集，說明此時存在著自噬小泡清除障礙，并且出現(xiàn)mTOR信號通路活性提高，均提示老齡SAMP8小鼠腦內(nèi)自噬活性下降。以上結(jié)論均揭示SAMP8小鼠腦內(nèi)存在著年齡相關(guān)的自噬活性改變，自噬可能參與了SAMP8小鼠腦老化過程。而在老齡SAMP8小鼠腦內(nèi)以及SAMP8來源的原代海馬神經(jīng)元內(nèi)均存在著自噬活性下降，mTOR通路活性提高，給予雷帕霉素抑制mTOR通路活性后可以保護(hù)神經(jīng)元，降低神經(jīng)元內(nèi)Tau蛋