以脫細胞犬動脈為基質的新型組織工程血管支架的制備和體外再細胞化研究.pdf

1、研究背景：隨著生活水平的提高和飲食結構的變化，人們患有心血管疾病的風險越來越大。許多情況下，病人需要通過血管的置換手術來提高生活質量甚至是挽救生命?；颊咦陨砥渌课坏难鼙徽J為是置換手術中的最好的材料，但大多數患者并不具備合適的可移植血管，尤其是實施多次手術的患者：另外這個手術的實施極易對患者會造成新的創(chuàng)傷。于是人們便開始尋找新型的血管替代材料，組織工程概念的提出為構建組織工程血管提供了理論依據和實驗方法。 制備脫細胞的異種血管

2、支架是目前組織工程血管研究領域的一個熱點。同其它類型的組織工程血管相比，脫細胞異種血管支架具備更多優(yōu)點。與合成材料為基質的組織工程血管相比，脫細胞異種血管支架具備更好的力學特征和生物相容性；與由胞外基質蛋白(膠原蛋白或彈性蛋白)交聯(lián)而成的支架相比，它具備更好的三維結構，更高的力學強度；同細胞自組裝的組織工程血管相比，它的制備更加簡單，同時制備的周期更短。 脫細胞血管支架比起其它類型的組織工程血管具備很多優(yōu)點，而且在許多動物試驗中

3、也得到證實。但有很多實驗結果表明，動物的在體細胞募集能力比人類強很多，即使是生物相容性較差的合成材料植入動物體內也能獲得較好的細胞化，因此，脫細胞支架在人體內能否取得同樣的效果還需要更多的臨床實驗結果來證明。事實上，脫細胞異種血管(或瓣膜)在人體內的實驗結果卻并不理想，主要原因是炎癥反應、鈣化以及支架材料的降解引起的并發(fā)癥。因此，脫細胞異種血管支架在人體內的得到廣泛應用之前，還有許多問題需要得到解決。首先，如何控制脫細胞血管支架在體內的

4、降解速度?通過對血管支架的膠原纖維進行交聯(lián)處理，不僅可以減緩材料的降解過程，為組織的重建提供更充裕的時間，還可以有效降低免疫原性和鈣化的發(fā)生。其次，如何實現脫細胞異種血管的體外再細胞化?有充分的證據表明，血管內皮細胞(EC)能夠有效防止血栓形成以及血管再狹窄所引起的血管阻塞，進而提高組織工程血管移植的成功率。但作為血管的另一個重要細胞成分平滑肌細胞(SMC)的體外再細胞化研究卻很少，而兩種細胞成分在組織工程血管上的聯(lián)合細胞化的研究更是屈

5、指可數。SMC和EC之間的相互作用達到某種平衡被認為是維持血管正常功能所必須的，用于研究SMC和EC之間相互關系的研究模型，不論是兩種細胞在PET膜兩側的共培養(yǎng)，或者在培養(yǎng)瓶中直接將EC種植于SMC細胞層上，都能證明SMC和EC之間能夠相互影響，這種影響不僅可以發(fā)生在形態(tài)學水平，還發(fā)生在分子生物學水平。因此，對脫細胞異種血管支架進行SMC和EC的聯(lián)合種植，將有利于使兩種細胞的增殖、分化和功能更接近于在體環(huán)境，提高組織工程血管移植的成功率

6、。 本研究中，我們對犬主動脈進行一系列脫細胞處理，并對制備出的脫細胞血管支架進行綜合評價，最后將在體外實現脫細胞血管支架的再細胞化，包括SMC和EC在支架材料上的單獨種植，以及EC在SMC上的聯(lián)合種植，擬制備出結構和功能更加完整的組織工程血管支架。具體方法如下： 研究方法 1．犬動脈的脫細胞處理我們實驗室的前期研究結果表明，應用多聚環(huán)氧化合物EX-810來處理主動脈，除了能夠有效地交聯(lián)支架的膠原纖維外，還能部分去

7、除支架內的細胞成分，同時保持胞外基質的結構的完整，而且表現出極小的細胞毒性。但是，EX-810的主要作用是引起細胞的破裂，而殘留的細胞碎片可能會導致鈣化的發(fā)生。因此我們加入了低鹽滲透和超聲的方法，加速細胞的破碎，同時更有效去除細胞殘片。試驗中應用HE染色，DAPI染色技術來檢測脫細胞的效果。 2．脫細胞犬動脈力學性能的評價除了上述對脫細胞犬動脈進行脫細胞效果檢測外，支架的力學性能評價也是判斷一種組織工程血管優(yōu)劣所必須的。力學性能

8、的檢測應用INSTRON8874生物力學測試系統(tǒng)(Instron Co．，USA)行單軸拉伸試驗，測定脫細胞犬動脈支架的各種力學指標，包括血管的最大荷載、最大荷載時的能量，最大荷載的伸長長度，以及最大荷載時的應變率。 3．脫細胞犬動脈的生物相容性檢測及體外再細胞化研究通過不同密度的SMC和EC在脫細胞犬動脈支架表面的種植，以及EC在不同密度的SMC表面的種植。一方面對支架材料的細胞相容性進行評價，另一方面確定在材料表面實現快速細

9、胞化所需要的細胞種植密度，以及如何實現EC和SMC在組織工程血管支架表面的直接聯(lián)合培養(yǎng)。用于主要的研究方法有掃描電鏡(SEM)、噻唑藍(MTT)和免疫組化染色。應用Image-Pro Plus圖像處理軟件對SEM圖片進行分析，計算細胞覆蓋率。 4．體外再細胞化的脫細胞犬動脈抵抗流體切應力的研究由于以合成材料為基質的大口徑血管支架已經在臨床上得到成功應用，本研究主要針對于小口徑組織工程血管的制備。因此為了檢驗種子細胞在支架材料表面

10、的粘附力，我們對細胞化的以脫細胞犬動脈為基質的組織工程血管支架施加5dyn/cm<'2>的流體切應力，作用時間分別為2h和4h，通過SEM來觀察細胞的粘附能力；同時利用Image-Pro Plus圖像處理軟件對SEM圖片進行分析，計算細胞覆蓋率，確定流體切應力作用前后細胞在組織工程血管支架表面的覆蓋率變化情況。 結果： 1．HE染色和DAPI染色法均表明，EX-810能夠有效降低犬動脈內的細胞成分，但脫細胞的效果并不徹底

11、。去離子水和超聲在某種程度上能夠提高EX-810的脫細胞效果。三者共同作用下，幾乎所有的細胞成分都能除去，同時胞外基質的三維結構保持完整。 2．經過EX-810、去離子水和超聲處理的脫細胞犬動脈，各種力學指標的差異均無顯著差異，說明脫細胞處理并沒有改變犬動脈的力學性能。 3．種子細胞(SMC和EC)在以脫細胞犬動脈為基質的組織工程血管支架表面生長良好。隨著接種密度的提高，種子細胞在材料上的排布更加有序；提高接種的密度有利

12、于在材料表面快速形成致密的細胞層。高密度接種EC能夠在不同接種密度的SMC上獲得致密的內皮細胞層，但內皮細胞的形態(tài)、內皮細胞的覆蓋率與SMC的接種密度有關。隨著底層SMC接種密度的增加，EC由典型的鋪路石狀變?yōu)殚L梭形，細胞的立體感加強；在中等SMC接種密度條件下，EC在SMC上的覆蓋率最高。 4．對再細胞化的以脫細胞犬動脈為基質的組織工程血管支架施加5dyn/cm<'2>切應力(2h和4h)，不論是EC單獨種植模型，還是EC在不

13、同密度SMC上的種植模型，致密的內皮細胞層沒有被破壞，說明我們制備以脫細胞犬動脈為基質的組織工程血管支架移植入體內后，種植的EC仍然能夠發(fā)揮正常的生理功能。 結論 1．應用EX-810、超聲和去離子水共同作用于犬動脈，能夠有效去除血管內的細胞成分，大大降低免疫原性。 2．以上脫細胞的方法能夠有效保持血管本身的力學性能。 3．制備出的以脫細胞犬動脈為基質的組織工程血管支架具有良好的細胞相容性，能夠在體外實現