MCM7與RACK1在肺癌中表達(dá)與臨床病理因素間關(guān)系.pdf

1、目的：
　　 RACK1(receptorfor activated Ckinase 1)為有活性的蛋白激酶C受體。蛋白激酶C的激活依賴于RACK1蛋白。RACK1的功能并不局限于PKC通路,作為支架蛋白及適應(yīng)蛋白,通過(guò)不同的WD40位點(diǎn),與細(xì)胞內(nèi)多種蛋白相互作用,參與細(xì)胞功能調(diào)控。微小染色體維持蛋白復(fù)合體(MCM)為DNA復(fù)制執(zhí)照系統(tǒng)成員之一,調(diào)控真核細(xì)胞的DNA復(fù)制,保證DNA復(fù)制在一個(gè)細(xì)胞周期中只有一次。MCM7為該復(fù)合體

2、的重要成分,并對(duì)維持MCM復(fù)合體的螺旋酶活性有重要意義,在控制DNA復(fù)制的過(guò)程中起關(guān)鍵作用,與細(xì)胞周期調(diào)控、轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞增殖密切相關(guān)。
　　 我們前期通過(guò)酵母雙雜交的篩選獲得了與MCM7相互作用的蛋白,分別是張力蛋白(tensin),調(diào)寧蛋白(calponinl),紐帶蛋白(vinculin),屬于細(xì)胞膜骨架的內(nèi)收蛋白1(adducin1),層粘連蛋白1(1aminin1)等。Rack1是MCM7相互作用蛋白。蛋白激酶C激活的特征

3、是由胞漿轉(zhuǎn)至胞膜或細(xì)胞骨架,這一轉(zhuǎn)位依賴于RACK1蛋白。RACK1缺乏的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力減弱。RACK1促進(jìn)細(xì)胞增殖。MCM7與RACK1蛋白結(jié)合,RACK1磷酸化MCM7,促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)展。
　　 有報(bào)道:RACK1抑制src激酶活性,在G1期抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、促進(jìn)凋亡;相反:乳腺癌中RACK1與細(xì)胞增殖密切相關(guān),其高表達(dá)預(yù)后差。因此RACK1與MCM7間作用尚需進(jìn)一步研究。
　　 本文應(yīng)用rt-pcr、western-bl

4、ot、免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MCM7與RACK1在肺癌中表達(dá),并探討二者與肺癌臨床病理因素間關(guān)系。
　　 材料與方法：
　　 1、標(biāo)本來(lái)源
　　 (1)肺癌組織
　　 收集中國(guó)醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科2010年3月至2011年12月手術(shù)切除的標(biāo)本,包括32例原發(fā)灶及相應(yīng)正常肺組織標(biāo)本。
　　 (2)石蠟切片
　　 購(gòu)買(mǎi)上海芯超生物科技有限公司組織芯片肺癌120點(diǎn)OD-CT-DgLug01-00

5、7、肺腺癌150點(diǎn)OD-CT-RsLug01-008、肺鱗癌150點(diǎn)OD-CT-RsLug01-009含有詳細(xì)病理資料及預(yù)后資料。
　　 2、試劑
　　 mousemonoclonalanti-RACK1購(gòu)自BD公司,mousemonoclonalanti-MCM7購(gòu)自SantaCruz公司。S-P免疫組化試劑盒(kit-9701)購(gòu)自福州邁新生物科技開(kāi)發(fā)有限公司,RT-PCR試劑盒購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

6、>　　 3、實(shí)驗(yàn)方法
　　 (1)RT-PCR
　　 收集組織標(biāo)本,提取RNA,RNA定量。反轉(zhuǎn)錄,PCR。電泳后經(jīng)發(fā)光。RNA帶經(jīng)BiolmagingSystems(UVP,CA,USA)采集后進(jìn)行灰度值測(cè)定,目的RNA灰度值與內(nèi)對(duì)照β-actin進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化后即為其相對(duì)RNA定量。
　　 (2)Westernblot
　　 收集組織標(biāo)本,提取總蛋白,蛋白定量。電泳后將蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上,然后用5%

7、BSA封閉,4℃一抗過(guò)夜,二抗37℃孵育2小時(shí)后ECL發(fā)光。蛋白條帶經(jīng)BiolmagingSystems(UVP,CA,USA)采集后進(jìn)行灰度值測(cè)定,目的蛋白灰度值與內(nèi)對(duì)照β-actin進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化后即為其相對(duì)蛋白定量。
　　 (3)免疫組織化學(xué)(S-P)法
　　 切片常規(guī)脫蠟、水化,3%過(guò)氧化氫去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶,高溫高壓熱修復(fù),檸檬酸鹽抗原修復(fù)液2min,蒸餾水沖洗5'×3遍、PBS沖洗5'×3遍,非免疫動(dòng)物血清室溫

8、孵育10min,以封閉特異性位點(diǎn),去血清加一抗MCM7(1:100)RACK1(1:200),4℃于冰箱孵育過(guò)夜,蒸餾水沖洗、PBS沖洗5'×3遍。加即用型廣譜試劑盒C液(鼠兔共用二抗)室溫孵育20min。蒸餾水沖洗、PBS沖洗5’×3遍,加即用型廣譜試劑盒D液,室溫20min。蒸餾水沖洗、PBS沖洗5'×3遍,DAB顯色。蘇木素復(fù)染,梯度酒精脫水,二甲苯透明,中性樹(shù)膠封片。
　　 結(jié)果評(píng)定標(biāo)準(zhǔn),以肺癌細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為

9、陽(yáng)性表達(dá),結(jié)合陽(yáng)性細(xì)胞百分比及陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)弱兩個(gè)方面評(píng)分結(jié)果評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)。MCM7、RACK1陽(yáng)性表達(dá)根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞百分率和染色程度進(jìn)行半定量結(jié)果判定:無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞記0分,陽(yáng)性細(xì)胞百分率≤50%記1分,51%-7596記2分,≥75%記3分:胞漿和/或細(xì)胞核基本不著色記0分,染色棕黃記1分,染色棕色記2分,染色褐色記3分。每張切片的陽(yáng)性細(xì)胞百分率得分和染色程度等分兩項(xiàng)相加作為最后得分?？偡?-1分記陰性(-),2-3分記為弱陽(yáng)性(+),4-5

10、分記為(++),6分以上記為強(qiáng)陽(yáng)性(+++);以陰性至弱陽(yáng)性為低表達(dá),陽(yáng)性至強(qiáng)陽(yáng)性為高表達(dá)。
　　 4、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析、相關(guān)性分析、X2檢驗(yàn)、Kaplan-Meier法等。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1、MCM7與RACK1在肺癌和癌旁組織中的表達(dá)
　　 對(duì)30例新鮮的腫癌和癌旁組織進(jìn)行We

11、sternBlot分析,結(jié)果顯示MCM7與RACK1在肺癌和癌旁組織中均有表達(dá),分子量MCM7約89kDa、RACK1約35kDa,但在肺癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織(P＜0.01)。
　　 對(duì)30例新鮮的肺癌和癌旁組織進(jìn)行RT-PCR分析,結(jié)果顯示MCM7與RACK1在肺癌和癌旁組織中均有表達(dá),分子量MCM7約345bp、RACK1約400bp,但在肺癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織(P＜0.01)。
　　 對(duì)(購(gòu)自上

12、海芯超生物科技有限公司的)肺鱗癌、肺腺癌組織芯片應(yīng)用s-p法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色,結(jié)果顯示MCM7與RACK1在肺癌和癌旁組織中均有表達(dá),MCM7主要是細(xì)胞核表達(dá),RACK1是細(xì)胞膜和漿表達(dá),二者在肺癌組織中的表達(dá)均明顯高于癌旁組織(P＜0.01)。
　　 2、MCM7與RACK1二者在肺癌中表達(dá)與臨床病理因素間關(guān)系
　　 免疫組化統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示,MCM7蛋白表達(dá)和RACK1蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.427,P=0.02

13、6)。兩者表達(dá)水平均與肺癌的病理分級(jí)(P=0.032,P=0.035)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移P=0.041,P=0.047)、組織分類(P=0.032),和臨床AJCC(P=0.043,P=0.036)相關(guān)。二者與患者年齡(P=0.545,P=0.606)無(wú)關(guān)。MCM7與性別(P=0.036)相關(guān),而RACK1與性別(P=0.587)無(wú)明顯相關(guān)性。
　　 3、MCM7與RACK1高表達(dá)患者生存時(shí)間縮短
　　 應(yīng)用Kaplan-Me

14、ier法分析MCM7、RACK1蛋白表達(dá)與各類型肺癌患者生存時(shí)間(P=0.006,P=0.002,Log-rank檢驗(yàn))的關(guān)系,顯示MCM7、RACK1高表達(dá)組(4-6分)生存時(shí)間明顯低于低表達(dá)組(0-3分)。
　　 4、MCM7與RACK1在肺癌中的表達(dá)正相關(guān)
　　 對(duì)MCM7與RACK1的表達(dá)進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析,Western(r=0.569,P=0.002),RT-PCR(r=0.379,P=0.047)

15、結(jié)果具有相關(guān)性。
　　 對(duì)肺癌組織芯片MCM7與RACK1蛋白表達(dá)應(yīng)用Spearman等級(jí)相關(guān)性分析,結(jié)果顯示二者具有相關(guān)性(r=0.427,P=0.026)。
　　 結(jié)論：
　　 1、MCM7與RACK1在肺癌中表達(dá)高于癌旁組織。
　　 2、MCM7與RACK1在肺癌中的表達(dá)與組織學(xué)分級(jí)、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和生存時(shí)間相關(guān)。
　　 3、MCM7與RACK1在肺癌中的表達(dá)具有正相關(guān)性。