JNK信號(hào)通路在二甲基胂酸所致人胚肺成纖維細(xì)胞DNA損傷和凋亡中的作用.pdf

1、砷是人類確定(Ⅰ類)致癌物，通過食用含有無機(jī)砷化物的水和食物所引起的砷中毒在全世界廣泛存在。另外一方面，砷還是多種腫瘤有效化學(xué)治療藥物，因此，環(huán)境和醫(yī)源性接觸砷化物的機(jī)會(huì)大大增加。二甲基胂酸(DMA)是無機(jī)砷在人體內(nèi)的主要的甲基化代謝產(chǎn)物，其本身也廣泛用作殺蟲劑。傳統(tǒng)的觀念一直認(rèn)為砷在體內(nèi)的甲基化過程是一個(gè)解毒促排泄過程，但是最近有研究表明DMA可引起細(xì)胞DNA斷裂，DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)和細(xì)胞凋亡，認(rèn)為DMA具有遺傳毒性和致癌性。最近越來

2、越多的研究表明砷的甲基化過程可能不僅僅是個(gè)解毒機(jī)制，砷在體內(nèi)的甲基化過程可能在砷致癌過程中發(fā)揮重要作用。目前關(guān)于砷甲基化代謝產(chǎn)物在體外毒性機(jī)制的研究較少，DMA損傷細(xì)胞的機(jī)制還不太清楚，其中關(guān)于信號(hào)通路在其中的作用的研究比較少。c-Jtm氨基末端激酶(JNK)信號(hào)通路是絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)家族信號(hào)通路的重要亞通路之一，其參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化與凋亡。有研究發(fā)現(xiàn)JNK信號(hào)通路在無機(jī)砷及其化合物所致細(xì)胞損傷中發(fā)揮一定作用。因此，闡

3、明DMA淞所致細(xì)胞損傷及其分子機(jī)制對(duì)于探討砷致癌分子機(jī)制及砷中毒的防治具有重要意義。 本課題擬探討不同濃度DMA對(duì)人胚肺成纖維細(xì)胞(HELF)增殖、DNA損傷、細(xì)胞周期和凋亡及JNK信號(hào)通路的影響；并應(yīng)用JNK抑制劑和反義抑制技術(shù)構(gòu)建JNK缺陷HELF胞，以阻斷JNK信號(hào)通路來深入探討JNK信號(hào)通路在DMA所致HELF細(xì)胞DNA損傷和凋亡中的作用，為進(jìn)一步揭示DMA所致細(xì)胞損傷的分子機(jī)制，全面了解砷的致癌分子機(jī)制和砷化物對(duì)機(jī)體的

4、影響提供一定的科學(xué)依據(jù)。 方法 一、DMA對(duì)HELF細(xì)胞增殖的影響用0.0、2.5、5.0、10.0、20.0μmol/L DMA分別處理HELF細(xì)胞12、24、48h，用MTT法和CCK-8法檢測(cè)HELF細(xì)胞相對(duì)增殖率，尋找其所致HELF細(xì)胞增殖的劑量-效應(yīng)和時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。 二、DMA對(duì)HELF細(xì)胞DNA損傷的影響用0.0、2.5、5.0、10.0、20.0μmol/L DMA分別處理HELF細(xì)胞12、24、

5、48h，收集HELF細(xì)胞蛋白，用Western blot檢測(cè)HELF細(xì)胞γ-H2AX蛋白表達(dá)水平，并用同一張膜上相應(yīng)泳道的β-actin條帶的灰度進(jìn)行校正。 三、DMA對(duì)HELF細(xì)胞周期的影響用0.0、2.5、5.0、10.0、20.0μmol/L DMA分別處理HELF細(xì)胞48h或用20.0μmol/L DMA分別處理HELF細(xì)胞12、24、48h，收集細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期的變化。 四、DMA對(duì)HELF細(xì)胞凋

6、亡的影響用0.0、2.5、5.0、10.0、20.0μmol/L DMA分別處理HELF細(xì)胞12、24、48h，分別用Hoechst 33258法檢測(cè)HELF細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)變化及細(xì)胞凋亡率和用Western blot檢測(cè)HELF細(xì)胞斷裂Caspase 3蛋白表達(dá)水平，尋找其劑量-效應(yīng)和時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。 五、DMA對(duì)HELF細(xì)胞磷酸化JNK表達(dá)水平的影響用0.0、2.5、5.0、10.0、20.0μmol/L DMA分別處理HEL

7、F細(xì)胞12、24、48h，收集HELF細(xì)胞蛋白，用Western blot檢測(cè)HELF細(xì)胞JNK、和磷酸化JNK蛋白表達(dá)水平，并用同一張膜上相應(yīng)泳道的β-actin條帶的灰度進(jìn)行校正。 六、JNK缺陷HELF細(xì)胞株建立從HELF細(xì)胞中抽提總RNA，用RT-PCR法擴(kuò)增目的DNA片段，經(jīng)重組技術(shù)構(gòu)建JNK基因反義RNA綠色熒光真核表達(dá)質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HELF細(xì)胞，經(jīng)G418篩選后，用Western blot檢測(cè)JNK蛋白含量，

8、確認(rèn)獲得JNK缺陷HELF細(xì)胞株。 七、抑制JNK對(duì)DMA所致細(xì)胞DNA損傷與凋亡的影響預(yù)先用20.0μmol/L JNK抑制劑SP600125處理HELF細(xì)胞30min，然后用20.0μmol/L DMA處理HELF細(xì)胞48h，再分別檢測(cè)HELF細(xì)胞DNA損傷和細(xì)胞凋亡情況。用20.0μmol/L DMA處理JNK缺陷HELF細(xì)胞(asJNK-HELF)和空載HELF細(xì)胞(C1-HELF)48h，再分別檢測(cè)這兩種細(xì)胞DNA損傷