ASGPR介導的靶向siRNA抑制HBV的復制與表達.pdf

1、目的：設計與構(gòu)建針對乙型肝炎病毒（HBV）基因的不同序列特異性siRNA載體，探討各si RNA對HepG2.2.15細胞HBV復制和表達的作用。篩選獲得具有高效沉默HBV的載體，以去唾液酸受體為靶點將其靶向HepG2.2.15細胞，觀察靶向與沉默效應、以及對細胞活性的影響，為進一步體內(nèi)靶向研究奠定基礎。
　　 方法：⑴特異性si RNA真核載體的構(gòu)建：設計并合成6對針對HBV基因的不同序列si RNA寡核苷酸，經(jīng)退火形成雙鏈，

2、然后經(jīng)T4連接酶連接，克隆入表達EGFP的真核載體，命名為pGenesil-siHBV1～6，并設立與HBV 序列無關的pGenesil-siHBV-HK作為陰性對照。⑵重組體的生物活性鑒定：將重組質(zhì)粒pGenesil-siHBV1～6和pGenesil-si HBV-HK 用脂質(zhì)體分別轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細胞。采用實時熒光定量PCR檢測轉(zhuǎn)染后2d、3d、4d靶基因的mRNA和細胞培養(yǎng)上清中cccDNA的水平；ELISA檢測轉(zhuǎn)染后2

3、d、3d、5d、7d細胞培養(yǎng)上清中HBsAg、HBeAg的表達。⑶去唾液酸受體的靶向作用：將具有高效沉默HBV的siRNA 載體利用j etPEI-Hepatocyte 靶向轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細胞，倒置相差熒光顯微鏡和流式細胞術(shù)（FCM）檢測細胞內(nèi)EGFP的表達，檢測轉(zhuǎn)染效率；FCM檢測細胞內(nèi)HBcAg的表達以及轉(zhuǎn)染后3d細胞的凋亡；ELISA檢測細胞培養(yǎng)上清中HBsAg、HBeAg的表達，細胞免疫化學酶標技術(shù)觀察細胞內(nèi)HBsAg

4、的表達。
　　 結(jié)果：①HBV特異性siRNA載體的構(gòu)建：PCR、酶切及測序鑒定結(jié)果表明，針對HBV基因特異性的siRNA 真核載體構(gòu)建成功。②HBV特異性siRNA 載體的生物活性：Real time-PCR、ELISa分別從mRNA、蛋白質(zhì)和cccDNA 水平檢測，結(jié)果表明pGenesil-siHBV1～6均可不同程度的抑制HBV的復制和抗原的表達，其中pGenesil-siHBV1的抑制效果最強。③ASGPR 靶向pGen

5、esil-siHBV1對HBV的沉默效應：將pGenesil-siHBV1利用j etPEI-Hepatocyte 靶向轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細胞，倒置相差熒光顯微鏡下可見綠色熒光，而無j etPEI-Hepatocyte轉(zhuǎn)染對照組未見綠色熒光，F(xiàn)CM檢測綠色熒光陽性細胞約為45％；FCM檢測細胞內(nèi)HBcAg的表達以及ELISA檢測靶向?qū)嶒灲M細胞培養(yǎng)上清中HBsAg、HBeAg的表達低于Lipofectamine TM 2000轉(zhuǎn)染對