Apert綜合征致病基因FGFR2E731K突變對成骨細(xì)胞分化及MVs礦化能力的影響.pdf

1、成纖維細(xì)胞生長因子受體（fibroblast growth factor receptors，F(xiàn)GFRs）家族有4種酪氨酸激酶家族成員(FGFR1-4)，他們可與22種FGFs配體形成二聚體激活PLC-γ、Ras/Raf/MEK/ERK、RJAK/STAT等下游信號通路，在骨的形成、血管形成、神經(jīng)形成、損傷修復(fù)、腫瘤形成等方面起重要作用。其中FGFR2在某些腫瘤、皮膚、骨骼等疾病的產(chǎn)生過程中起關(guān)鍵作用，F(xiàn)GFR2多種突變可以導(dǎo)致一種骨罕

2、見疾病-Apert綜合征的發(fā)生。Apert綜合征(Apert Syndrome，AS)又稱(I)型尖頭并指（趾）綜合征(acroocephalo syyndactyly)，是顱縫早閉（Craniosynostosis）類疾病當(dāng)中最嚴(yán)重的一種，是一種罕見疾病，新生兒發(fā)病率在1/160，000與1/65，000之間。1906年，Apert首次對其進(jìn)行了報(bào)道，屬于常染色體顯性疾病，是由FGFR2基因突變引起的，并且該病患兒多為散發(fā)患者，由新生

3、突變引起。其主要癥狀為尖頭、短頭、面中部發(fā)育不良及并指（趾）畸形等。最近Park等在對一名Apert病人的研究中發(fā)現(xiàn)了FGFR2基因的一種新的突變類型，即E731K突變。對這～新的突變的初步研究中發(fā)現(xiàn)，在沒有FGF配體結(jié)合的情況下，F(xiàn)GFR2激酶能夠發(fā)生自身磷酸化激活ERK-MAP通路。Apert綜合征是一種典型的單基因單位點(diǎn)突變引起的遺傳疾病，對于研究骨礦化異常引起的疾病是一個(gè)良好的模型，在對很多骨礦化方面的研究中體外實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果很

4、多時(shí)候不能在體內(nèi)得到驗(yàn)證，是因?yàn)轶w內(nèi)和體外環(huán)境有很大差異，而對于這一疾病模型的研究中我們只要得到FGFR2的致病突變則會使體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ桶l(fā)生礦化異常，減少環(huán)境差異對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。為了進(jìn)一步研究FGFR2基因E731K突變導(dǎo)致Apert綜合征的原因以及更進(jìn)一步的闡述FGFR2E731K突變對成骨細(xì)胞基質(zhì)小泡(matrix vesicles，MVs)的礦化能力影響，我們設(shè)計(jì)了以下實(shí)驗(yàn)。
　　目的:本研究旨在闡述引起Apert綜合征的F

5、GFR2E731K突變在體外影響成骨細(xì)胞礦化的機(jī)制以及這種機(jī)制與基質(zhì)小泡(matrix vesicles，MVs)之間的關(guān)系以及對MVs的影響，為進(jìn)一步研究FGFR2基因的功能和MVs與疾病的聯(lián)系提供一種新思路。
　　方法:本研究擬采用人骨肉瘤細(xì)胞系Saos-2，通過將FGFR2(fibroblastgrowth factor receptor2，F(xiàn)GFR2)基因的野生型和FGFR2E731K突變用慢病毒載體轉(zhuǎn)入Saos-2細(xì)胞中

6、進(jìn)行過表達(dá)來檢測FGFR2E731K突變對成骨細(xì)胞礦化和MVs礦化的影響。本研究擬采用外顯子測序的方法首先排除Saos-2細(xì)胞中原本表達(dá)的FGFR2基因有無功能性突變位點(diǎn)，然后對慢病毒轉(zhuǎn)染之后的MT(突變型FGFR2E731K)細(xì)胞和WT（野生型FGFR2細(xì)胞）用β-磷酸甘油和抗壞血酸誘導(dǎo)后，檢測其堿性磷酸酶(ALP)活性并用茜素紅染色的方法檢測兩種細(xì)胞的礦化能力，同時(shí)用熒光定量PCR的方法檢測兩種細(xì)胞中礦化標(biāo)志蛋白ALP、Runx2、

7、OCN、Col1A1的mRNA水平表達(dá)情況來研究FGFR2E731K突變在細(xì)胞水平上對成骨細(xì)胞礦化的影響。然后采用ExoQiuck試劑提取兩種細(xì)胞的MVs，檢測其ALP活性和用吸光度檢測其礦化懸液的渾濁度的方法檢測其礦化能力，來研究FGFR2E731K突變對MVs的礦化活性的影響。
　　結(jié)果:(1)測序證明Saos-2細(xì)胞FGFR2基因外顯子中沒有功能突變位點(diǎn)，可以進(jìn)行突變功能研究。(2)ALP和茜素紅實(shí)驗(yàn)均發(fā)現(xiàn)MT(突變型FGF

8、R2E731K)細(xì)胞和WT（野生型FGFR2）細(xì)胞在抗壞血酸和β-磷酸甘油的誘導(dǎo)下，MT細(xì)胞的ALP活性和礦化結(jié)節(jié)數(shù)均明顯高于WT細(xì)胞。(3)熒光定量PCR的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ALP、Runx2、OCN、Col1A1這四種礦化標(biāo)志基因在MT細(xì)胞中比在WT細(xì)胞中有明顯的表達(dá)上調(diào)。(4) MVs的ALP活性檢測結(jié)果和吸光度實(shí)驗(yàn)表明，相較于WT細(xì)胞中提取的MVs，MT細(xì)胞中提取的MVs有著更高的ALP活性，在相同時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生的羥基磷灰石(HA)也更