CRES蛋白抗病原微生物作用及其機(jī)制研究.pdf

1、生殖道感染是危害男性生殖健康的主要因素之一，也是引起男性不育的重要原因。CRES蛋白—胱蛋白酶抑制劑相關(guān)的附睪精子發(fā)生蛋白(cystatin-relatedepididymalspermatogenicprotein)又稱為CST8，屬于胱蛋白酶抑制劑超家族中Family2即cyatatins的一個(gè)亞類。CRES蛋白特異地表達(dá)于小鼠睪丸和附睪，其表達(dá)譜具有明顯的年齡變化規(guī)律，提示其可能在精子發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用，但研究發(fā)現(xiàn)Cres基因

2、敲除小鼠生育力正常。CRES蛋白具有四個(gè)保守的半胱氨酸殘基，通過形成兩個(gè)二硫鍵來維持其三維結(jié)構(gòu)。近年來，陸續(xù)有文獻(xiàn)報(bào)道CST3、CST11具有抗菌功能，這些報(bào)道促使我們研究該亞類中另一個(gè)成員—CRES蛋白是否也具有抗病原微生物功能。
　　首先，我們采用GST融合蛋白表達(dá)系統(tǒng)成功地表達(dá)純化了可溶性CRES蛋白(GST-CRES)。然后采用菌落形成單位法和分光光度測定法檢測CRES蛋白是否具有抗大腸桿菌（E.coli)和溶脲脲原體（U

3、reaplasmaurealyticum，Uu）的功能。結(jié)果顯示，與培養(yǎng)至對數(shù)生長期的E.coli或Uu共孵育，CRES蛋白可抑制E.coli或Uu的生長，且這種效應(yīng)具有明顯的時(shí)間—劑量依賴性。應(yīng)用定點(diǎn)突變技術(shù)使CRES蛋白第105位或/和第139位的半胱氨酸殘基突變?yōu)榻z氨酸殘基，以分別破壞或同時(shí)破壞其兩個(gè)二硫鍵，繼而研究二硫鍵突變體的抗E.coli及抗Uu功能。結(jié)果顯示，與正常的GST-CRES蛋白類似，二硫鍵突變體同樣具有明顯的抗E

4、.coli和抗Uu功能，說明CRES蛋白的抗微生物功能不依賴于其二硫鍵發(fā)揮作用。進(jìn)而，我們區(qū)段表達(dá)CRES蛋白并檢測其活性發(fā)現(xiàn)，N端的30個(gè)氨基酸(N30)完全失去了抗微生物的活性，而N60與CRES全長蛋白相似，均可明顯抑制E.coli和Uu的生長，表明CRES蛋白的抗微生物活性中心可能存在于其N端第31至60個(gè)氨基酸之間。最后研究了CRES蛋白對E.coli通透性和大分子物質(zhì)(DNA、RNA、Protein)合成的影響來探討其抗菌機(jī)