黃芩黃酮類組分對尼古丁誘導的肺癌進展的影響及機制.pdf

1、肺癌是當今世界最常見的惡性腫瘤之一，也是對人類生存和健康構成極大威脅的惡性腫瘤。在我國，肺癌也已成為惡性腫瘤的頭號殺手。吸煙是肺癌發(fā)病的一個重要誘因，大約80％的男性患者和50％的女性患者都有吸煙史。中國疾病預防控制中心等部門發(fā)布的《控煙與中國未來》顯示，2002年至2010年中國煙民的數(shù)量一直保持在3億以上。到2030年，中國因吸煙而導致的年死亡人數(shù)將達到300萬，占40歲以上人群死亡歸因總數(shù)的25％。因此，對吸煙誘發(fā)的肺癌的防治是目

2、前研究的重點。尼古丁是煙草中的主要成癮性組分，其能誘導腫瘤細胞增殖，促進腫瘤血管生成，促進腫瘤的侵襲轉移，通過多種途徑加速肺癌的發(fā)生發(fā)展。
　　中國傳統(tǒng)醫(yī)學雖無肺癌這一病名，但古代醫(yī)家對其癥狀、病因、病機等早有描述，并認為“煙為辛熱之魁”，火熱是煙致肺積的重要病機。中醫(yī)藥治療肺癌具有緩解癥狀、改善生存質量、延長生存期、配合放化療減毒增效以及防止轉移的作用。黃芩是傳統(tǒng)的清熱中藥，具有清熱燥濕、瀉火解毒等功效。黃芩中主要的黃酮類組分黃

3、芩苷、黃芩素和漢黃芩素具有廣泛的抗腫瘤活性?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)黃芩黃酮類組分對多種肺癌細胞株均有抑制作用，但黃芩黃酮類組分對尼古丁誘導的肺癌進展的影響尚未見報道。為此本研究將就黃芩黃酮類組分對尼古丁誘導的肺癌進展的作用及機制進行研究，并以補腎組分淫羊藿苷作為對照，將為黃芩黃酮類組分抗腫瘤的臨床應用提供客觀而科學的理論基礎和實驗依據(jù)，并為肺癌的臨床治療提供新的有效藥物和優(yōu)選方案，從而為肺癌的臨床治療開辟新的有效途徑。本課題研究內容分為三部分。

4、>　　第一部分黃芩黃酮類組分對人肺癌A549細胞和H1299細胞增殖和凋亡的影響
　　目的:
　　1.觀察黃芩黃酮類組分對尼古丁誘導的人肺癌細胞株A549和H1299的生物學效應;
　　2.探討黃芩黃酮類組分對尼古丁誘導的人肺癌細胞株A549和H1299凋亡的作用機制。
　　方法:
　　1.將人肺癌細胞株A549和H1299細胞分別暴露于尼古?。ńK濃度為10-8M和10-6M）和不同濃度的黃芩苷、黃芩素、漢

5、黃芩素和淫羊藿苷（終濃度為50μM、10μM、1μM和10μM）中，觀察黃芩黃酮類組分對尼古丁誘導的A549細胞和H1299細胞形態(tài)學的影響，以CCK-8法檢測黃芩黃酮類組分對尼古丁誘導的A549細胞和H1299細胞增殖的影響，以流式細胞術觀察黃芩黃酮類組分對尼古丁誘導的A549細胞和H1299細胞凋亡的影響;
　　2.以Real-time PCR法和Western blot法檢測尼古丁誘導的人肺癌細胞株A549細胞和H1299細

6、胞中凋亡相關基因和蛋白bcl-2、bax和pro-caspase3的變化情況，以進一步明確黃芩黃酮類組分對尼古丁誘導的人肺癌細胞株A549細胞和H1299細胞凋亡的作用機制。
　　結果:
　　1.黃芩黃酮類組分能顯著抑制尼古丁誘導的人肺癌A549細胞和H1299細胞增殖，尤以黃芩素和漢黃芩素作用更為顯著。黃芩黃酮類組分作用后的A549細胞和H1299細胞呈現(xiàn)細胞凋亡的典型表現(xiàn)，AnnexinⅤ聯(lián)合PI法染色結果進一步明確了黃

7、芩黃酮類組分的促凋亡作用，黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素對尼古丁誘導的A549細胞的早期凋亡率分別是6.90±0.40、19.63±1.23和22.5±3.22，對尼古丁誘導的H1299細胞的早期凋亡率分別是11.82±2.73、14.04±4.27和12.55±2.74，與尼古丁組均有顯著性差異。而淫羊藿苷不能抑制尼古丁誘導的H1299細胞增殖和凋亡，早期凋亡率與尼古丁組無顯著性差異;
　　2.黃芩黃酮類組分作用于人肺癌A549細胞4

8、8h后，黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素可顯著抑制bcl-2 mRNA和蛋白表達，黃芩苷顯著抑制bax mRNA表達，但對bax蛋白表達無影響，漢黃芩素顯著促進bax mRNA表達，黃芩素和漢黃芩素均促進bax蛋白表達，黃芩素和漢黃芩素顯著抑制bcl-2/bax mRNA比值和pro-caspase-3 mRNA表達，三者均顯著抑制bcl-2/bax和pro-caspase-3蛋白表達。黃芩黃酮類組分作用于人肺癌H1299細胞48h后，黃芩苷、

9、黃芩素和漢黃芩素可顯著抑制bcl-2、bax和pro-caspase-3 mRNA和蛋白表達，黃芩素顯著抑制bcl-2/bax mRNA比值，但三者均對bcl-2/bax蛋白比值無影響。淫羊藿苷可促進bcl-2 mRNA表達，但對bax mRNA、caspase-3 mRNA和bcl-2/bax mRNA比值以及凋亡相關蛋白表達無影響。
　　第二部分黃芩黃酮類組分對人肺癌A549細胞和H1299細胞侵襲轉移和炎癥微環(huán)境的影響

10、>　　目的:
　　1.觀察黃芩黃酮類組分對尼古丁誘導的肺癌侵襲轉移的影響;
　　2.觀察黃芩黃酮類組分對尼古丁誘導的肺癌炎癥微環(huán)境的影響;
　　3.探討黃芩黃酮類組分對尼古丁誘導的肺癌侵襲轉移和炎癥微環(huán)境的影響機制。
　　方法:
　　1.采用細胞劃痕實驗研究黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素和淫羊藿苷（終濃度為50μM、10μM、1μM和10μM）對尼古丁誘導的人肺癌A549細胞和H1299細胞遷移的影響。采用Tra

11、nswell侵襲實驗研究黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素對尼古丁誘導的人肺癌A549細胞和H1299細胞侵襲能力的影響;
　　2.采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)研究黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素對尼古丁誘導的人肺癌A549細胞和H1299細胞TNF-α和IL-6的影響;
　　3.采用Real-time PCR法和Western blot法檢測黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素對尼古丁誘導的人肺癌細胞株A549細胞和H1299細胞中MMP-2、M

12、MP-9、NF-κBp65和IκB-α mRNA和蛋白的影響。
　　結果:
　　1.黃芩黃酮類組分能顯著抑制尼古丁誘導的人肺癌A549細胞和H1299細胞侵襲轉移，尤以黃芩素和漢黃芩素作用更為顯著。黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素均顯著下調A549細胞和H1299細胞的侵襲轉移相關基因MMP-2和MMP-9mRNA表達，黃芩素和漢黃芩素明顯抑制A549細胞的MMP-2和MMP-9蛋白表達，三種黃芩黃酮類組分均明顯抑制H1299細胞的

13、MMP-2和MMP-9蛋白表達。淫羊藿苷不能抑制尼古丁誘導的H1299細胞侵襲轉移，對MMP-2和MMP-9 mRNA和蛋白表達亦無影響;
　　2.黃芩黃酮類組分對尼古丁誘導的兩種肺癌細胞株的炎癥微環(huán)境具有顯著地抑制作用。黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素均能抑制A549細胞IL-6和TNF-α表達和H1299細胞TNF-α表達，黃芩苷和黃芩素能抑制H1299細胞IL-6表達。黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素均抑制A549細胞和H1299細胞中NF

14、-κB p65mRNA和蛋白表達，上調H1299細胞的IκB-αmRNA和蛋白表達，但對A549細胞的IκB-α mRNA和蛋白表達無影響。淫羊藿苷不能抑制尼古丁誘導的H1299細胞TNF-α和IL-6表達，對H1299細胞的NF-κB p65和IκB-α mRNA和蛋白表達亦無影響。
　　第三部分黃芩黃酮類組分對尼古丁誘導的小鼠Lewis肺癌移植瘤的作用及機制
　　目的:
　　探討黃芩黃酮類組分對尼古丁誘導的小鼠Le

15、wis肺癌移植瘤的抑瘤作用及其機制。
　　方法:
　　1.60只C57小鼠接種Lewis肺癌細胞，一周后將荷瘤鼠隨機分為6個組，每組10只:對照組、尼古丁組、尼古丁+黃芩苷80mg/kg組、尼古丁+黃芩素40mg/kg組、尼古丁+漢黃芩素40mg/kg組和尼古丁+淫羊藿苷50mg/kg組。從分組后一周開始除對照組和尼古丁組給予生理鹽水灌胃外，其余各組給予相應藥物灌胃，每天1次，共28天。從分組后兩周開始除對照組外，其余各組給

16、予尼古丁1mg/kg腹腔注射，每周3次，共3周。末次用藥后處死小鼠，處死前用游標卡尺測量腫瘤的最長徑(a)和最短徑(b)，計算瘤體體積V=a×b2/2。處死后小心剝離種植瘤，將瘤體稱重。
　　2.采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)研究黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素對尼古丁誘導的Lewis肺癌小鼠移植瘤的VEGF、TNF-α和IL-6的影響;
　　3.采用Western blot法檢測黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素對尼古丁誘導的Lewis

17、肺癌小鼠移植瘤的bcl-2、bax和caspase-3蛋白表達的影響;
　　4.采用免疫組織化學法檢測黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素對尼古丁誘導的Lewis肺癌小鼠移植瘤的CD31和NF-κB p65表達的影響，通過CD31表達計算腫瘤微血管密度(MVD)。
　　結果:
　　1.黃芩黃酮類組分可顯著抑制尼古丁誘導的肺癌移植瘤增殖，尤以黃芩素和漢黃芩素作用更為顯著。黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素均能抑制尼古丁誘導的凋亡轉移相關蛋白b

18、cl-2和caspase-3表達，下調bcl-2/bax比值，漢黃芩素能促進尼古丁誘導的bax蛋白表達。淫羊藿苷雖能抑制bcl-2表達，上調bax表達，下調bcl-2/bax比值，但不能抑制caspase-3表達，對尼古丁誘導的瘤體積和瘤重無影響;
　　2.漢黃芩素能顯著抑制尼古丁誘導的肺癌移植瘤的微血管生成，而黃芩素對尼古丁誘導的腫瘤新生血管形成無影響，黃芩苷則促進尼古丁誘導的腫瘤微血管生成。黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素均能顯著抑制

19、尼古丁誘導的肺癌移植瘤的VEGF表達。淫羊藿苷雖可抑制尼古丁誘導的腫瘤微血管密度，但對VEGF表達無影響;
　　3.黃芩黃酮類組分對尼古丁誘導的肺癌移植瘤的炎癥微環(huán)境具有顯著地抑制作用。黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素均能抑制IL-6表達，黃芩苷和黃芩素能抑制TNF-α表達。三種黃芩黃酮類組分均能抑制瘤組織中NF-κB表達。淫羊藿苷雖能抑制尼古丁誘導的瘤組織NF-κB表達，但對IL-6和TNF-α表達無影響。
　　結論:
　　

20、1.黃芩黃酮類組分對尼古丁誘導的人肺癌A549細胞和H1299細胞均有明顯的抑制作用，尤以黃芩素和漢黃芩素作用更為顯著。黃芩黃酮類組分可顯著抑制尼古丁誘導的凋亡相關基因和蛋白Bcl-2表達，上調Bax表達，降低bcl-2/bax比值，下調Pro-caspase-3的表達，啟動線粒體凋亡途徑，從而誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡。
　　2.黃芩黃酮類組分對尼古丁誘導的人肺癌A549細胞和H1299細胞的轉移侵襲均有顯著地抑制作用，尤以黃芩素和漢

21、黃芩素作用更為顯著，其機制可能與下調侵襲轉移相關基因和蛋白如MMP-2和MMP-9的表達有關。
　　3.黃芩黃酮類組分對尼古丁誘導的A549細胞和H1299細胞的炎癥微環(huán)境具有顯著地抑制作用，表現(xiàn)為抑制IL-6和TNF-α表達，其機制可能與抑制兩種細胞的NF-κB p65蛋白表達，上調H1299細胞的IκB-α蛋白表達有關。
　　4.黃芩黃酮類組分可顯著抑制尼古丁誘導的肺癌移植瘤增殖，尤以黃芩素和漢黃芩素作用更為顯著，其機制

22、可能與下調凋亡相關蛋白bcl-2和caspase-3表達，下調bcl-2/bax比值，最終導致黃芩黃酮類組分對尼古丁誘導的肺癌移植瘤的促凋亡作用有關。黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素對尼古丁誘導的肺癌移植瘤的微血管生成的作用分別為促進、無影響和抑制，但三者均能顯著抑制尼古丁誘導的肺癌移植瘤的VEGF表達。此外，黃芩黃酮類組分對尼吉丁誘導的肺癌移植瘤的炎癥微環(huán)境具有顯著地抑制作用，表現(xiàn)在抑制IL-6和TNF-α表達，其機制可能與抑制瘤組織中NF-

23、κB表達有關。
　　5.在體外實驗中，淫羊藿苷不能抑制尼古丁誘導的H1299細胞增殖及細胞凋亡，亦對凋亡下游信號無影響;淫羊藿苷不能抑制尼古丁誘導的H1299細胞侵襲轉移，亦對MMP-2和MMP-9表達無影響;不能抑制尼古丁誘導的IL-6和TNF-α表達，對NF-κB p65和IκB-α表達的影響與尼古丁組亦無影響。在體內實驗中，淫羊藿苷雖能抑制bcl-2表達，上調bax表達，下調bcl-2/bax比值，但不能抑制caspase-