黃酮類成分分析

1、,黃酮類成分分析,一、結(jié)構(gòu)特征及理化性質(zhì)結(jié)構(gòu)特征 基本母核：2-苯基色原酮（C6-C3-C6）理化性質(zhì)物理性狀結(jié)晶性固體或無定形粉末。大多數(shù)呈黃色，其顏色的有無與交叉共軛體系有關(guān)。如：黃酮、黃酮醇及其苷類多呈黃色；二氫黃酮、二氫黃酮醇及黃烷醇呈無色；異黃酮呈無色或微黃色。溶解性,游離苷元—易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙醚等有機(jī)溶及稀堿水黃酮苷—易溶于水、甲醇、乙醇等強(qiáng)極性溶劑,,,酸堿性酸性：與酚羥基

2、的數(shù)目和位置有關(guān) 7,4’- 二羥基> 7或4’- 羥基> 一般酚羥基> 5-羥基堿性：r-吡喃酮環(huán)上的1-位氧原子，可表現(xiàn)出微弱堿性顯色反應(yīng) 還原反應(yīng)（鹽酸鎂粉反應(yīng)） 與金屬鹽類試劑的配合反應(yīng)（鋁、鉛、鋯、鎂鹽） 硼酸顯色反應(yīng)堿性試劑反應(yīng) 五氯化銻反應(yīng) Gibb’s反應(yīng)和E

3、merson反應(yīng)光譜特征 I帶(300-400nm) →B環(huán)桂皮?；?II帶(240-285nm) →A環(huán)苯甲?；?,,,色譜法 1.薄層色譜法硅膠--分離鑒別弱極性黃酮類化合物遵循正相色譜原理，化合物極性越大，所選擇的展開劑極性也相應(yīng)增大，同時根據(jù)化合物酸性強(qiáng)弱調(diào)節(jié)展開劑的酸堿性。常用展開劑有苯-甲醇等。聚酰胺--分離檢識含游離酚羥基的黃酮及其苷利用氫鍵吸附原理，由于聚酰胺

4、和黃酮類化合物上酚羥基形成氫鍵締合，所以作用力較強(qiáng)，需要極性強(qiáng)的展開劑，而在展開劑中大多含有醇、酸或水，或兼有兩者。所以，分離檢識游離黃酮常用有機(jī)溶劑作為展開劑，如氯仿- 甲醇等；而分離檢識黃酮苷常用含水有機(jī)溶劑作為展開劑，如甲醇- 水等。纖維素--分離黃酮類多糖苷混合物展開系統(tǒng)：正丁醇-乙酸-水，5%~40%乙酸 展開好的色譜，常在紫外燈（365nm）下觀察熒光斑點(diǎn)及其顏色；亦可噴三氯化鋁試劑，在日光燈或紫外燈下觀

5、察熒光是否加強(qiáng)；也可氨熏，是否出現(xiàn)黃色、棕色熒光斑點(diǎn)等。,,2.紙色譜法 適用于分離各種類型的黃酮化合物，包括游離黃酮和黃酮苷類。 混合物的檢識常采用雙向色譜法，第一向采用醇性展開劑如正丁醇-乙酸-水（4:1:5上層，BAW）等，此為正相分配色譜，極性小的化合物比極性大的化合物Rf值大。第二向采用水性展開劑，如水、 2%~6%乙酸等，其色譜行為類似于反向色譜，極性大的化合物比極性小的化合物Rf值大。

6、 游離黃酮類化合物的檢識，一般宜用醇性展開劑；花色素及花色苷的檢識可用含鹽酸或乙酸的水溶液作展開劑。 多數(shù)黃酮類化合物在紙色譜上用紫外燈檢查時，可以看到有色點(diǎn)，以氨蒸氣處理后常產(chǎn)生明顯的顏色變化。此外，還可以噴以2%AlCl3甲醇溶液（在紫外燈下檢查）或1%FeCl3-1%K3Fe(CN)6(1:1)水溶液等顯色劑。,,三、含量測定 中藥制劑中含有黃酮類成分，可按要求測定總黃酮含量、黃酮類單

7、體含量或兩者均須測定。含量測定方法主要有分光光度法、薄層色譜法、高效液相色譜法等。（一）、總黃酮含量測定 1.分光光度法一般用于總酮類成分的含量測定。大多數(shù)黃酮類化合物在甲醇溶液中的紫外吸收光譜由兩個主要吸收帶組成。 帶Ⅰ—出現(xiàn)在300~400nm之間的吸收帶 帶Ⅱ—出現(xiàn)在240~285nm之間的吸收帶 含黃酮類化合物的原料藥及部分制劑經(jīng)必要的提取純化后，可直接于最大吸收波長附近

8、測定總黃酮的吸光度，對照品的選定應(yīng)以最大吸收波長與總黃酮的相近為原則，單體黃酮和總黃酮均可作為對照品，常以蘆丁等對照品計(jì)算總黃酮的含量?！吨袊幍洹?015版中淫羊藿總黃酮的含量測定（書P156頁）,,,2 .鋁鹽配位比色法 本法采用分光光度法測定中藥中黃酮類成分，若供試液中其他組分的吸收存在干擾，可進(jìn)行比色測定。該法利用黃酮類成分與鋁鹽發(fā)生配位反應(yīng)，生成的配合物與背景最大吸收波長差別較大，可消除背景（即陰性空白）的干

9、擾，顯著提高含量測定的選擇性。（1）硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法 將中藥通過適當(dāng)方法制成供試液 加5%亞硝酸鈉反應(yīng)6min 10%硝酸鋁反應(yīng)6min 4%氫氧化鈉反應(yīng)15min 生成紅色配合物后在500nm測定，常用蘆丁作為對照品。 （ＰＳ：該法是基于鄰二酚羥基的反應(yīng)，并非黃酮類化合物的專

10、屬反應(yīng)。）　　垂盆子顆粒中總黃酮含量測定—鋁鹽配位比色法　（見書ｐ156頁）（2）三氯化鋁—醋酸鉀比色法 常用蘆丁為對照品，采用三氯化鋁—醋酸鉀為顯色劑，顯色后在420nm波長處測定黃酮類成分含量。 (p S:黃酮類化合物與三氯化鋁—醋酸鉀反應(yīng)后最大吸收波長并不一定都 在420nm處，因此，最好用所含黃酮作對照品） 消咳喘糖漿中總黃酮含量測定-鋁鹽配位比色法 見書p1

11、57頁,,,（二）、單體黃酮含量測定薄層掃描法樣品經(jīng)適宜的溶劑提取得到供試液，經(jīng)硅膠、聚酰胺或纖維素薄層 色譜有效分離后，用薄層掃描儀直接進(jìn)行含量測定。對黃酮類單體 既可以進(jìn)行紫外-可見光掃描，又可以進(jìn)行熒光掃描。高效液相色譜法正相色譜(多用于沒有羥基或乙?；S酮類成分化合物） 固定相為硅膠，流動相可套用薄層色譜條件，但極性要相對小一點(diǎn)。反相色譜（C18或C8） 固定相多為十八烷基硅烷鍵合相

12、 流動相：甲醇-水-乙酸（磷酸緩沖液），乙腈-水檢測器：紫外檢測器或熒光檢測器,,銀杏葉提取物總黃酮醇苷含量測定 [含量測定]色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-0.4%磷酸溶液（50：50）為流動相；檢測波長為360nm。理論板數(shù)按槲皮素峰計(jì)算應(yīng)不低于2500，山柰素酚峰與異鼠李素峰的分離度應(yīng)大于1.5。 對照品溶液的制備（略） 供試品溶液的制備 取本品10片，除去包衣，精密稱

13、定，研細(xì)，取約相當(dāng)于總黃酮醇苷19.2mg的粉末，精密稱定，精密加入甲醇20ml，稱定重量，超聲處理20分鐘，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液10ml，置100ml錐形瓶中，加甲醇10ml、25%鹽酸溶液5ml，搖勻，置水浴中加熱回流30分鐘，迅速冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移至50ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.45μm）濾過，取濾液，即得。 測定法 分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各

14、10μl，注入液相色譜儀，測定，分別計(jì)算槲皮素、山奈素和異鼠李素的含量，按下式換算成總黃酮苷的含量。 總黃酮醇苷含量=（槲皮素含量+山奈素含量+異鼠李素含量）×2.51,,,,常見的黃酮類成分分析 p158~p159,,中藥名稱:葛根成分: 葛根素定性鑒別方法：取本品粉末0.8g，加甲醇10ml，放置2小時，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状?.5ml使溶解，作為供試品溶液。另取葛根對照藥材0.8g，同法制

15、成對照藥材溶液。再取葛根素對照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（通則0502）試驗(yàn)，吸取上述三種溶液各10μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，使成條狀，以三氯甲烷-甲醇-水（7：2.5：0.25）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光條斑。理化特征：溶于甲醇，略溶于乙醇，微溶于水，三氯甲烷或乙醚中不溶。Mp:1

16、87℃（分解）UV:254nm常用分析方法：HPLC;TLCS;紫外分光光度法,,中藥名稱：槐花 成分：蘆丁定性鑒別方法：取本品粉末0.2g，加甲醇5ml，密塞，振搖10分鐘，濾過，取濾液作為供試品溶液。另取蘆丁對照品，加甲醇制成每1ml含4mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（通則0502）試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各10μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-水（8：1：1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以三氯

17、化鋁試液，待乙醇揮干后，置紫外光燈（365nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。理化性質(zhì)：易溶于堿水；可溶于熱水、甲醇、乙醇、吡啶；微溶于丙酮、乙酸乙酯；難溶于冷水、苯、乙醚、三氯甲烷。Mp:177~178℃ ;UV:259,266,299,359nm常見分析方法：HPLC;TLCS;紫外分光光度法,,中藥名稱：黃芩成分：黃芩苷定性鑒別方法：取本品粉末1g，加乙酸乙酯-甲醇（3：1

18、）的混合溶液30ml，加熱回流30分鐘，放冷，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状?ml使溶解，取上清液作為供試品溶液。另取黃芩對照藥材1g，同法制成對照藥材溶液。再取黃芩苷對照品、黃芩素對照品、漢黃芩素對照品，加甲醇分別制成每1ml含1mg、0.5mg、0.5mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（通則0502）試驗(yàn)，吸取上述供試品溶液、對照藥材溶液各2μl及上述三種對照品溶液各1μl，分別點(diǎn)于同一聚酰胺薄膜上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（

19、10：3：1：2）為展開劑，預(yù)飽和30分鐘，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)；在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯三個相同的暗色斑點(diǎn)。  理化性質(zhì)：易溶于二甲基甲酰胺、吡啶，微溶于熱冰乙酸、碳酸氫鈉和氫氧化鈉等溶液，難溶于甲醇、乙醇、丙酮，幾乎不溶于水、乙醚、苯、三氯甲烷。Mp:233℃ UV:242,272,310nm常見分析方法：HPLC,TL

20、CS,,中藥名稱：淫羊藿 成分：淫羊藿苷定性鑒別方法：取本品粉末0.5g，加乙醇10ml，溫浸30分鐘，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)右掖?ml使溶解，作為供試品溶液。照薄層色譜法（通則0502）試驗(yàn)，吸取供試品溶液和〔含量測定〕淫羊藿苷項(xiàng)下的對照品溶液各10μl，分別點(diǎn)于同一硅膠H薄層板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水（10：1：1：1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯

21、相同的暗紅色斑點(diǎn)；噴以三氯化鋁試液，再置紫外光燈（365nm）下檢視，顯相同的橙紅色熒光斑點(diǎn)。 理化性質(zhì)：溶于乙醇、乙酸乙酯，不溶于醚、苯、三氯甲烷。Mp:231~232℃ UV:272nm常見分析方法：HPLC;TLCS,,中藥名稱：陳皮成分：橙皮苷定性鑒別方法：取本品粉末0.3g，加甲醇10ml，加熱回流20分鐘，濾過，取濾液5ml，濃縮至1ml，作為供試品溶液。另取橙皮苷對照品，加甲醇制成飽和溶液，作為對照品溶液。照薄層

22、色譜法（通則0502）試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各2μl，分別點(diǎn)于同一用0.5%氫氧化鈉溶液制備的硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇-水（100：17：13）為展開劑，展至約3cm，取出，晾干，再以甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水（20：10：1：1）的上層溶液為展開劑，展至約8cm，取出，晾干，噴以三氯化鋁試液，置紫外光燈（365nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。 理化性質(zhì)：在60℃溶于二甲基酰胺及甲酰

23、胺。略微溶于甲醇及熱冰醋酸，幾乎不溶于水，丙酮、苯及三氯甲烷。而易溶于稀堿及吡啶。Mp:258~262℃ UV:284nm常見分析方法：HPLC;TLCS,,中藥名稱：銀杏葉 成分：槲皮素定性鑒別方法：取本品粉末1g，加50%丙酮溶液40ml，加熱回流3小時，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0ml使溶解，用乙酸乙酯振搖提取2次，每次20ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)?5%乙醇5ml使溶解，加入已處理好的聚酰胺柱（30～60目，1

24、g，內(nèi)徑為1cm，用水濕法裝柱）上，用5%乙醇40ml洗脫，收集洗脫液，置水浴上蒸去乙醇，水液用乙酸乙酯振搖提取2次，每次20ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)颖?ml使溶解，作為供試品溶液。另取銀杏內(nèi)酯A對照品、銀杏內(nèi)酯B對照品、銀杏內(nèi)酯C對照品及白果內(nèi)酯對照品，加丙酮制成每1ml各含銀杏內(nèi)酯A0.5mg、銀杏內(nèi)酯B0.5mg、銀杏內(nèi)酯C0.5mg、白果內(nèi)酯1mg的混合溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（通則0502）試驗(yàn)，吸取上述

25、兩種溶液各5μ1，分別點(diǎn)于同一用4%醋酸鈉溶液制備的硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-丙酮-甲醇（10：5：5：0.6）為展開劑，在15℃以下展開，取出，晾干，在醋酐蒸氣中熏15分鐘，在140～160℃中加熱30分鐘，置紫外光燈（365nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。 理化性質(zhì)：略溶于無水乙醇，易溶于沸乙醇，溶于冰醋酸、堿性水溶液呈黃色，幾乎不溶于水。Mp：314℃（分解）常見分析方法：