損傷相關(guān)分子模式及相關(guān)受體在小鼠急性肝損傷中的表達(dá)和意義.pdf

1、背景及目的:損傷相關(guān)分子模式(DAMPs)是引發(fā)無菌性炎癥和固有免疫應(yīng)答的內(nèi)源性危險(xiǎn)信號,常在缺血、缺氧及急性臨床事件等導(dǎo)致組織損傷的情況下由壞死細(xì)胞被動(dòng)釋放,或由受刺激的單核/巨噬細(xì)胞主動(dòng)分泌。DAMPs通過作用于模式識別受體(PRRs),激活下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,誘導(dǎo)固有免疫應(yīng)答及炎癥反應(yīng)。研究表明,高遷移率族蛋白1(HMGB1)是一類重要的DAMPs及炎癥介質(zhì),釋放至胞外的HMGB1可與晚期糖化終產(chǎn)物受體(RAGE)結(jié)合激活固有免疫細(xì)

2、胞介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。三磷酸腺苷(ATP)在生理狀態(tài)下是胞內(nèi)能量貯存和供應(yīng)物質(zhì),應(yīng)激狀態(tài)下也可被釋放至細(xì)胞外,通過與嘌呤受體P2X7的作用,激活炎癥復(fù)合體,引起白介素-1β(IL-lβ)及IL-18等前炎癥細(xì)胞因子合成和釋放,參與并維持炎癥反應(yīng)。急性肝損傷常表現(xiàn)為免疫反應(yīng)介導(dǎo)的肝細(xì)胞的壞死和炎癥,其中 T細(xì)胞及巨噬細(xì)胞(Kupffer cells)的激活是免疫介導(dǎo)肝損傷的主要機(jī)制,但肝細(xì)胞在受損后釋放的DAMPs是否參與了巨噬細(xì)胞的進(jìn)一步活化

3、及炎癥細(xì)胞因子分泌以及在急性肝損傷進(jìn)程中的作用,目前尚不十分清楚。本研究擬通過建立刀豆蛋白A(ConA)誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷模型,動(dòng)態(tài)觀察DAMPs及其受體在肝損傷組織中的表達(dá)變化,及與炎癥細(xì)胞因子TNF-α,IL-1β分泌之間的關(guān)系,探討內(nèi)源性危險(xiǎn)信號在急性肝損傷發(fā)生發(fā)展中的作用,為進(jìn)一步闡明無菌性肝損傷發(fā)生的免疫學(xué)機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:將昆明種小鼠隨機(jī)分為NS對照組、ConA實(shí)驗(yàn)組,分別于注射后的6個(gè)時(shí)間點(diǎn)留取血標(biāo)本及

4、肝組織標(biāo)本,用賴氏法檢測血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)活力;化學(xué)發(fā)光技術(shù)檢測血清中胞外ATP(eATP)水平;蘇木素-伊紅(HE)染色法檢查肝組織病理學(xué)改變;RT-PCR技術(shù)檢測肝組織 HMGB1,RAGE,腫瘤壞死因子-α(TNF-α),白介素-1β(IL-lβ)mRNA的表達(dá);免疫組化法檢測肝組織 HMGB1蛋白的表達(dá);Western-blot技術(shù)檢測肝組織RAGE,P2X7受體及核因子NF-κB p

5、65的表達(dá);ABC-ELISA法檢測血清中TNF-α,IL-lβ含量。
　　結(jié)果:成功構(gòu)建ConA誘導(dǎo)小鼠肝損傷模型;ConA注射2h,肝組織HMGB-1 mRNA表達(dá)即增加,至18h達(dá)峰值(P<0.01);HMGB1蛋白在受損肝組織中的表達(dá)則明顯聚集于壞死區(qū)域;實(shí)驗(yàn)組肝組織RAGE mRNA于12h表達(dá)上調(diào);RAGE蛋白的表達(dá)于24h達(dá)到峰值,與NS組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);ConA注射后2h,實(shí)驗(yàn)組釋放至血清的eAT

6、P水平出現(xiàn)增高,并于注射后18h達(dá)峰值(700nmol/L);但實(shí)驗(yàn)組與對照組小鼠肝組織表達(dá)的P2X7受體則未見明顯改變;ConA注射2h后,肝組織NF-κB p65水平顯著增高,約為對照組的4倍,至48h一直維持較高水平;實(shí)驗(yàn)組小鼠肝組織TNF-αmRNA表達(dá)分別在6,24h出現(xiàn)兩個(gè)峰值,血清TNF-α含量在注射ConA后2h達(dá)峰值(455.25ng/L),隨后逐漸降低,至48h與NS組相比無明顯差異;ConA組各時(shí)間點(diǎn)小鼠肝組織與血