應用高密度單核苷酸多態(tài)性芯片分析人類胰腺癌基因組異常.pdf

1、為了揭示胰腺癌發(fā)生的分子機制，提高早期診斷和提供治療新方法，本文應用高密度的單核苷酸多態(tài)性分析芯片，研究25種胰腺癌細胞株基因組的基因擴增，缺失，以及雜合性缺失等染色體異常。 材料與方法： 一、材料 我們研究了25種人類胰腺癌細胞株，分別來自美國，目本和歐洲的細胞庫。 其中16種(AsPC-1，BxPC-3，Capan-l，Capan-2，CFPAC-1，HPAF-Ⅱ，Hs 700T，Hs766T，PAN

2、C-1，Panc 02.03，Panc 03．27，Panc 05．04，Pane 08．13，Panc 10．05，SU．86．86，和SW 1990)是從美國American Type Culture Collection(ATCC，Manassas，VA)獲得，5種(KP-1N，KP-2，KP-3，KP-4，and MIA PaCa-2)從日本的Japanese Collection ofResearch Bioresources

3、(JCRB，Osaka，Japan)獲得，KLM-1和NOR-P1來自日本的Institute of(Development，Aging and Cancer，Tohoku University，Japan．T3M-4和PSN1分別來自日本RIKEN BioResource Center(Tsukuba，Japan)和歐洲EuropeanCollection ofCell Cultures(ECACC，Salisbury，UK)。細胞在

4、推薦的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。二、主要試劑及儀器DNA提取試劑盒PUREGENE DNA Isolation Kit(Oentra Systems，Minneapolis，MS)。 SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)試劑。 Affymetrix基因芯片系統(tǒng)包括Affymetrix全自動芯片洗滌工作站，Affymetrix高分辨率芯片掃描儀，Aff

5、ymetrix雜交箱。 實時熒光定量PCR系統(tǒng)是ABI PRISM 7000 Sequence Detection System。 PCR儀是Applied Biosystems GeneAmp PCR System 9600． 三、芯片制作和分析從細胞株中提取DNA，用2種限制性內(nèi)切酶XbaⅠ或HindⅢ消化，末端連接adapter后進行PCR。PCR產(chǎn)物片斷化后，末端進行標志(labeling)，然后與Aff

6、ymetrix公司的GeneChip<○R>Human Mapping 100K Mapping microarray上的探針雜交。檢測基因芯片上的近100，000個的SNP探針的熒光信號，應用CNAG軟件，分析胰腺癌基因組的擴增，缺失，以及雜合性缺失(LOH)。 四、芯片結果驗證詳細分析25種胰腺癌細胞的數(shù)據(jù)，篩選可能與胰腺癌發(fā)生和發(fā)展有關的基因，用PCR驗證缺失，實時熒光定量PCR(Real Time-PCR)確認擴增。

7、 結果： 染色體DNA片段擴增出現(xiàn)在2種以上細胞的共同擴增區(qū)域有23處。最小擴增區(qū)域為146kb。最普遍的擴增片段在12p12.1-12p11.23，出現(xiàn)在6種細胞株中。平均每個區(qū)域有4.87個基因。 其中，1q42.2-q42.3，2q36.3，3q25.1，5p15.2，10q23.32，11q21，13q22.2，19p13.12是新發(fā)現(xiàn)的區(qū)域。 二、染色體DNA片段純合性缺失(honlozygous

8、deletions)25種胰腺癌細胞株基因組中，發(fā)現(xiàn)并證實26個區(qū)域有DNA片段純合性缺失，其中20個區(qū)域只有1個候選基因，4處有2個候選基因，2處有4個候選基因，平均每個區(qū)域有1.38個基因。最小純合性缺失片段長度是6 kb，最普遍的片段在9p21.3，出現(xiàn)在11種細胞株中。 新發(fā)現(xiàn)了7個純合性缺失片段，分別位于2q22.1，6q22.33，9q22.33，20p12.1，XP21.2)，Xp21.1，Xq2613。

9、三、雜合性缺失所有的腫瘤細胞都有不同程度的雜合性缺失，高頻率的(50％以上)LOH出現(xiàn)在9p，18q，17p，8p，13q，6q，3p，6p，22q，9q，12q等處。最普遍的區(qū)域是在9p和18q，出現(xiàn)在22種細胞株中。 結論： 1、應用Affmetrix GeneChip<○R>Hmnan Mapping 100K基因芯片和分析軟件CNAG，可以同時詳細分析胰腺癌的基因缺失，擴增和LOH。 2、高密度的單核苷酸