肝細(xì)胞癌和膽囊癌基因表達(dá)譜分析及肝癌相關(guān)基因單核苷酸多態(tài)性研究.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)部分展開論述：
　　第一部分 肝癌相關(guān)AFP和HNF1A基因單核苷酸多態(tài)性研究
　　單核苷酸多態(tài)性(SNP)是基因組水平上的DNA多態(tài)性，可發(fā)生在基因編碼區(qū)和非編碼區(qū)，與疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本研究在課題組前期原發(fā)性肝癌易感性基因系列研究基礎(chǔ)上，重點(diǎn)聚焦AFP和HNF1A基因非編碼區(qū)SNP位點(diǎn)多態(tài)性的研究，尋找這些位點(diǎn)與HCC易感性之間的關(guān)聯(lián)，以及它們對(duì)基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控機(jī)制。我們通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)-連接酶方法

2、(Polymerase chain reaction-Ligation detection reaction，PCR-LDR)對(duì)來(lái)自中國(guó)漢族人群的1058例樣本進(jìn)行了SNP位點(diǎn)基因型檢測(cè)。檢測(cè)的SNP位點(diǎn)包括:AFP基因SNP位點(diǎn)rs6834059、rs4018和rs4024，以及HNF1A基因SNP位點(diǎn)rs73539。通過(guò)病例對(duì)照研究，評(píng)估了這些位點(diǎn)與HBV感染以及HBV相關(guān)HCC之間的關(guān)聯(lián)性。然后，我們通過(guò)構(gòu)建rs4024和rs73

3、5396位點(diǎn)野生型和突變型的熒光報(bào)告載體，初步研究了它們對(duì)基因轉(zhuǎn)錄活性的影響。我們通過(guò)體外EMSA實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了它們對(duì)基因轉(zhuǎn)錄活性的影響。結(jié)果顯示AFP的SNP位點(diǎn)rs6834059和rs4024基因多態(tài)性分別與HCC患者是否伴有肝硬化和TNM分期存在統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)。rs6834059位點(diǎn)G/G基因型在伴有肝硬化的HCC患者中比例更高(P=0.038，OR=2.72，95％CI:1.02-7.26)，而rs4024位點(diǎn)G/G基因型在高TN

4、M分期的HCC患者中比例更高(P=0.031，OR=1.88，95％CI:1.05-3.37)。此外，rs735396位點(diǎn)多態(tài)性與HBV相關(guān)HCC易感性之間存在顯著相關(guān)性，攜帶A/A基因型人群具有更高的HCC患病風(fēng)險(xiǎn)(P=0.024，OR=1.55，95％CI:1.06-2.26)。熒光報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果顯示rs4204位點(diǎn)G/G基因型和rs735396位點(diǎn)G/G基因型具有更高的轉(zhuǎn)錄活性。此外，EMSA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示rs4204位點(diǎn)G/G與

5、A/A基因型之間結(jié)合所在調(diào)控序列的核蛋白能力存在差異。結(jié)論:通過(guò)病例對(duì)照研究，我們發(fā)現(xiàn)了AFP基因SNP位點(diǎn)rs735396多態(tài)性與HCC的易感性顯著相關(guān)，而AFP基因SNP位點(diǎn)rs6834059和rs4024多態(tài)性與HCC的進(jìn)展顯著相關(guān)。進(jìn)一步功能學(xué)研究揭示了rs735396和rs4204位點(diǎn)多態(tài)性在基因轉(zhuǎn)錄中的調(diào)控作用。
　　第二部分 肝細(xì)胞癌與肝硬化基因表達(dá)譜差異分析
　　肝硬化(Cirrhosis)是肝細(xì)胞癌(HCC

6、)高危風(fēng)險(xiǎn)因素，易進(jìn)展為HCC并最終導(dǎo)致死亡。本研究旨在比較HCC和Cirrhosis組織之間的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)從Cirrhosis演變?yōu)镠CC過(guò)程中的關(guān)鍵基因(Hub genes)，以及這些基因在疾病過(guò)程中的作用。我們從高通量基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)(Gene expression Omnibus，GEO)下載了4個(gè)HCC和Cirrhosis相關(guān)數(shù)據(jù)集，并將HCC組織樣本和正常肝組織樣本數(shù)據(jù)合并為HCC數(shù)據(jù)集，將Cirrhosis組織樣本數(shù)據(jù)

7、定義為C數(shù)據(jù)集合。然后，我們使用WGCNA軟件包構(gòu)建了HCC和C數(shù)據(jù)集的權(quán)重基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，獲得顯著共表達(dá)的基因模塊，并通過(guò)flashClust和dynamicTreeCut軟件包對(duì)得到的基因模塊進(jìn)行了分析，根據(jù)連接度計(jì)算篩選到出Hub基因。最后，應(yīng)用DAVID在線數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)模塊特異性基因以及Yellow模塊中Hub基因進(jìn)行功能注釋，并通過(guò)Cytoscape軟件可視化顯示功能注釋網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果顯示在排除了離群樣本后，HCC數(shù)據(jù)集包含有394個(gè)

8、HCC組織樣本和29正常肝組織樣本數(shù)據(jù)，C數(shù)據(jù)集包含215個(gè)肝硬化組織樣本數(shù)據(jù)。HCC數(shù)據(jù)集構(gòu)建了6個(gè)基因模塊，分別標(biāo)記為:藍(lán)、棕、青綠、綠色、紅色和黃色。其中的藍(lán)、棕、青綠在HCC和C數(shù)據(jù)集之間具有高保守性，而黃色保守性最低。這些模塊中的基因已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)與轉(zhuǎn)錄、有絲分裂、陽(yáng)離子運(yùn)輸、陽(yáng)離子穩(wěn)態(tài)以及環(huán)化酶的分泌和調(diào)控有關(guān)。黃色基因模塊中包含有編碼細(xì)胞因子的基因，例如:CCL22和IL19，這些細(xì)胞因子可在HCC的發(fā)生過(guò)程中起到重要的作用。

9、結(jié)論:通過(guò)HCC與Cirrhosis組織基因表達(dá)譜的WGCNA比較分析，發(fā)現(xiàn)了6個(gè)顯著共表達(dá)的基因模塊，其中一個(gè)基因模塊可能與肝硬化進(jìn)展為HCC緊密相關(guān)。通過(guò)Hub基因分析，我們發(fā)現(xiàn)了一些在肝硬化和肝細(xì)胞癌之間差異表達(dá)的基因，它們可能是HCC進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮作用的重要因子。對(duì)這些基因進(jìn)一步的功能研究，將有助于我們更好地了解HCC發(fā)病的分子機(jī)制。
　　第三部分 基于RNA-Seq的膽囊癌轉(zhuǎn)錄組研究
　　膽囊癌是一種相對(duì)少見的的惡

10、性腫瘤，具有高惡性程度、易早期轉(zhuǎn)移、難于早期發(fā)現(xiàn)、對(duì)化療藥物不敏感等特點(diǎn)。本研究旨在通過(guò)對(duì)癌組織(TT)與癌旁組織(ANTT)之間差異表達(dá)基因(DEGs)的研究，發(fā)掘差異表達(dá)基因?qū)δ懩野┬纬珊桶l(fā)展的影響機(jī)制，為尋找新的診治靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。首先，我們從本實(shí)驗(yàn)室前期研究的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-Seq)數(shù)據(jù)中挑選了16個(gè)DEGs。然后，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(Real-time PCR)，在一個(gè)包含35例膽囊癌患者的獨(dú)立樣本中，對(duì)這些DE

11、Gs進(jìn)行了驗(yàn)證。而且，我們結(jié)合臨床隨訪信息，在差異表達(dá)基因與臨床數(shù)據(jù)之間進(jìn)行了關(guān)聯(lián)性分析。結(jié)果顯示其中有12個(gè)差異表達(dá)基因在驗(yàn)證組的表達(dá)數(shù)據(jù)與RNA-Seq數(shù)據(jù)一致。BIRC5、TK1、TNNT1和MMP9基因表達(dá)水平與膽囊癌手術(shù)后預(yù)后相關(guān)。BIRC5基因表達(dá)與TNM(tumor-node-metastasis)分期之間存在顯著相關(guān)性。此外，我們還發(fā)現(xiàn)血清CA19-9檢測(cè)值與TNNT1、MMP9和CLIC3基因表達(dá)水平之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性