應(yīng)用單核苷酸多態(tài)性芯片對肺鱗癌全基因組拷貝數(shù)變異和雜合性缺失的研究.pdf

1、目的：非小細(xì)胞肺癌是我國發(fā)病最高的惡性腫瘤,由于缺乏有效的早期發(fā)現(xiàn)方法,因而確診時(shí)多屬晚期,除了手術(shù)之外,尚無其他的有效治療方法。術(shù)后5年生存率只有約15％。同其他腫瘤一樣,非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多階段,受多基因調(diào)控的過程,由多種腫瘤相關(guān)基因表達(dá)失常或腫瘤抑制基因失活所致。因此要了解癌變過程中的基因變化,需要研究整個(gè)基因組的異常。研究表明染色體區(qū)段拷貝數(shù)增加和減少即拷貝數(shù)變異(copy number variationCNV)直

2、接造成位于該區(qū)段的基因拷貝數(shù)發(fā)生變化,影響基因表達(dá)水平,導(dǎo)致表型差異。抑癌基因所在的染色體區(qū)段的雜合性缺失(loss of heterzygosity LOH)是一些上皮和間質(zhì)來源的腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的重要事件。肺癌遺傳變異的研究方法主要包括核型分析,熒光原位雜交(fluorescent in situ hybridizationFISH),比較基因組雜交(comparative genomic hybridization CGH)等

3、。CGH只能檢測到擴(kuò)增或缺失數(shù)目的異常,但不能發(fā)現(xiàn)Allelic homozygosity(AH),這需要研究在腫瘤細(xì)胞中是一種非常常見的DNA變異一雜合性缺失,抑癌基因的雜合性缺失會(huì)導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生,全基因組掃描LOH傳統(tǒng)方法包括微衛(wèi)星標(biāo)記法(polymorphic microsatellite markers)和限制性片段長度多態(tài)性(retriction fragmentlength polymorphism,RFLP),但是這兩種方

4、法很費(fèi)時(shí)費(fèi)勁。SNP是人類基因組里最普遍的多態(tài)性遺傳標(biāo)志。Affymectrix Genome-wide SNP6.0芯片選取約906,600個(gè)位點(diǎn)分析各位點(diǎn)的基因型,同時(shí)芯片又能提供各位點(diǎn)兩種等位基因型的拷貝數(shù)(CN),得到位點(diǎn)所在區(qū)段的CN和LOH情況,對基因組分析達(dá)到極高的分辨率(<10kb)。本研究的目的是通過應(yīng)用SNP芯片對肺癌腫瘤組織進(jìn)行全基因組掃描,探討肺癌組織基因拷貝數(shù)擴(kuò)增、缺失,以及雜合性缺失等遺傳變異與肺癌發(fā)生的相關(guān)

5、性,旨在揭示肺鱗癌發(fā)生的分子機(jī)制,提高早期診斷和提供治療新方法。本研究應(yīng)用SNP芯片檢測15例肺鱗癌全基因組CNV和LOH遺傳變異信息,進(jìn)一步研究全基因組的拷貝數(shù)擴(kuò)增,缺失,以及雜合性缺失等染色體異常,從全基因組水平對肺鱗癌的分子遺傳機(jī)制異常進(jìn)行初步探討。
　　 方法：提取15例肺鱗癌患者的肺癌組織和配對的遠(yuǎn)癌肺組織的全基因組DNA并用于Affymetrix Genome-wide SNP6.0芯片檢測。芯片探針雜交信號強(qiáng)度的數(shù)

6、據(jù)使用Affymetrix專用軟件GTC3.0分析SNP位點(diǎn)基因型和拷貝數(shù)得到全基因組的CNV,LOH,純合性缺失區(qū)域等信息。
　　 結(jié)果:1.Genome-wide SNP6.0芯片的QC Call rate都超過了質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。15張芯片的QC Call rate最低的為95.07％,最高的為99.26％,平均為97.49％,Contrast QC最低為2.08,最高為3.75,平均為2.73,MAPD最低為0.16,最高為0.

7、28,平均為0.22,表明芯片雜交質(zhì)量良好。
　　 2.15例肺癌組織分析結(jié)果中CN為2的片段共181個(gè),占1.26％,片段長度最短的為100kb,最長的為3,995kb。CN為4的片段共226個(gè),占1.57％,片段長度最短的為100kb,最長的為34,862kb。CN為3的片段共6,018個(gè),占41.9％,片段長度最短的為100kb,最長的為25,654kb。CN為1的片段共7,837個(gè),占54.6％,片段長度最短的為100k

8、b,最長的為86,897kb。
　　 3.15例肺癌組織中CNV中Loss主要分布在第4號染色體(7.11％,1001/14081),3號染色體(6.22％,876/14081),5號染色體(4.92％,693/14081),1號染色體(4.06％,572/14081),10號染色體(3.14％,442/14081)等染色體上,gain主要分布在7號染色體(4.99％,702/14081),2號染色體(4.57％,643/140

9、81),8號染色體(4.09％,576/14081),1號染色體(3.88％,547/14081),12號染色體(3.49％,491/14081)等染色體上。其中g(shù)ain片段數(shù)量最少的是C08-0342,共7個(gè)片段,最多的是C08-0027,共877個(gè)片段；loss片段數(shù)量最少的是C08-0085,共4個(gè)片段,最多的是C08-0027,共1,628個(gè)片段。
　　 4.15例肺癌組織分析結(jié)果中都有不同程度的雜合性缺失,15例肺癌組

10、織檢測出各個(gè)樣本含有不同數(shù)量的LOH位點(diǎn)。15例肺癌組織總共檢出1,921,845個(gè)LOH位點(diǎn),其中LOH位點(diǎn)數(shù)量最少的為C08-0142,共計(jì)54,274個(gè)LOH位點(diǎn),LOH位點(diǎn)數(shù)量最多的為C08-0027,共計(jì)400,078個(gè)LOH位點(diǎn)。其中不同染色體也有不同的LOH位點(diǎn)數(shù)量,其發(fā)生率由高至低依次前5條染色體為第X號染色體(28.1％,540105/1921845),第1號染色體(7.14％,137282/1921845),第5號染

11、色體(6.89％,132347/1921845),第3號染色體(6.19％,119014/1921845),第4號染色體(6.11％117336/1921845)。15例肺癌組織的X染色體上均能檢測到LOH位點(diǎn),共檢測到31,793個(gè)LOH位點(diǎn)。
　　 5.15例肺癌組織分析結(jié)果中檢測到純合性缺失區(qū)域(CN=0)共92處,分別位于第1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,12,13,14,15,16,17,18,19,21,X

12、,Y號染色體上,其發(fā)生率由高到低依次為第4號染色體(21.7％,20/92),第5號染色體(11.9％,11/92),第3號染色體(9.8％,9/92),Y染色體(8.7％,8/92),第X染色體(7.6％,7/92),第19號染色體(6.5％,6/92),第17號染色體(5.4％,5/92),第1號染色體(4.3％,4/92),第8,10,15,18號染色體(3.3％,3/92),第7號染色體(2.2％,2/92),第2,6,9,12

13、,13,14,16,21號染色體(1.1％,1/92)。最小的缺失片段在第19號染色體的q13.1,長度為101kb,最長的缺失片段在第3號染色體的p12.3~p12.2,長度為7,146kb。
　　 結(jié)論：(1)Genome-wide SNP6.0基因芯片和分析軟件Genome TypingConsole3.0,可以同時(shí)詳細(xì)分析肺鱗癌的染色體缺失,擴(kuò)增和LOH,純合性缺失區(qū)域；(2)Genome-wide SNP6.0基因芯片