松花粉多糖及其酯化物對小鼠胰島細胞胰島素分泌機制的研究.pdf

1、硫酸酯化后的馬尾松花粉多糖,部分羥基被硫酸基取代,從而具有了靜電排斥效應和空間位阻,改變了多糖原有的空間結構,易與蛋白質的特定結構域結合,從而影響其功能和生物活性的改變.經本實驗室研究發(fā)現(xiàn):60％乙醇沉淀的馬尾松花粉多糖(PPM60)及其酯化物(SPPM60)可以不同程度地提高大鼠心肌細胞、小鼠脾細胞的細胞內游離鈣離子濃度;同時降低了原代培養(yǎng)的大鼠血管平滑肌細胞內的游離鈣離子濃度([Ca2+]i).而[Ca2+]i是胰島素分泌的重要影響

2、因素之一.
　　馬尾松花粉多糖及其酯化物是否作用于胰島β細胞,引起細胞內鈣離子濃度的變化,從而導致胰島素的分泌,目前還不清楚.本實驗對馬尾松花粉多糖及酯化物引起小鼠胰島β細胞胰島素分泌的機制進行初步探討.為松花粉多糖的利用及開發(fā)輔助治療糖尿病的新藥提供思路.本實驗可分為以下三部分.
　　一、馬尾松花粉多糖(PPM60)的分離純化、硫酸酯化及鑒定:選取60％乙醇沉淀組分PPM60用Sephacryl S-400HR凝膠柱層析對

3、多糖進行分離純化,分離出PPM60-A、PPM60-B、PPM60-C三種分子量較均一的組分.用氯磺酸-吡啶法對PPM60及其純化的各部分進行硫酸酯化修飾,得到白色絮狀產物SPPM60、
　　SPPM60-A、SPPM60-B和SPPM60-C.用氯化鋇-明膠比濁法對酯化多糖進行SO42-含量測定并計算其取代度分別為1.494、1.58、1.31、1.19.紫外、紅外光譜顯示:其具有多糖類的特征吸收峰和硫酸酯鍵(C-O-S和S=O

4、)的特征吸收峰,這些表明此松花粉多糖硫酸酯化成功.
　　二、PPM60及SPPM60對小鼠胰島β細胞(MIN6細胞系)胰島素分泌的影響:用酶聯(lián)免疫吸附實驗法檢測PPM60及SPPM60刺激后MIN6細胞上清液中胰島素的分泌量.200μg/mL的SPPM60刺激細胞1小時,對MIN6細胞胰島素分泌有極顯著地促進作用.而PPM60對MIN6細胞的胰島素分泌幾乎沒有作用.加入L型鈣離子通道的抑制劑維拉帕米或細胞內鈣庫上的IP3受體的抑制

5、劑低分子肝素鈉后,再加SPPM60進行刺激,對于SPPM60引起的胰島素分泌有一定程度的抑制作用,但作用不顯著.
　　三、SPPM60對MIN6細胞內游離鈣離子濃度([Ca2+]i)的影響:MIN6細胞經過鈣離子熒光探針Fura2-AM負載后,用熒光分光光度計檢測SPPM60作用后[Ca2+]i的變化.SPPM60在5min作用時間內,與對照組相比能促進細胞內[Ca2+]i顯著升高.加入 L型鈣離子通道抑制劑維拉帕米(Verapa

6、mil)后再加 SPPM60刺激,部分抑制了SPPM60引起的[Ca2+]i升高.加入細胞內鈣庫IP3受體抑制劑低分子肝素鈉(LMWH)后再加SPPM60刺激,[Ca2+]i與單獨加入SPPM60組相比有顯著性降低,但是沒有降到空白水平.
　　以上結果表明:(1)PPM60對MIN6細胞胰島素分泌幾乎沒有影響,硫酸酯化后的SPPM60能顯著促進胰島素的分泌.(2)SPPM60促進MIN6細胞胰島素分泌可能與細胞內游離鈣離子濃度的升