兔脂肪干細胞BrdU標記情況的初步研究.pdf

1、目的：研究5-溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)標記脂肪間充質(zhì)干細胞(ADSCs)的效果，確定體外標記的最佳濃度和時間，評價BrdU標記的ADSCs的適用性。 方法：取6月齡新西蘭白兔頸后皮下脂肪，采用I型膠原酶消化方法體外分離培養(yǎng)脂肪干細胞，利用成骨、成脂誘導培養(yǎng)基定向向成脂、成骨細胞誘導并用組織化學方法鑒定其誘導結(jié)果，從而鑒定其具有多向分化的干細胞潛能。選取第3代ADSCs，分別采用5、10、15、20μmol/L濃度的BrdU體

2、外標記干細胞24、48、72小時，利用免疫組化實驗計算不同濃度和標記時間下脂肪干細胞的標記率，確定BrdU對ADSCs的最佳標記方法。通過臺盼藍染色和細胞倍增時間的測量確定最佳標記方法的安全性。對第3代脂肪干細胞采用最佳標記方法標記后更換為普通培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，適時傳代，連續(xù)檢測第5、7、9、11代脂肪干細胞的Brdu標記率，了解該標記方法在脂肪干細胞體外擴增培養(yǎng)過程中的衰減情況。同時將標記后的第3代脂肪干細胞作為實驗組，未標記細胞作為對

3、照組，分別種植于乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)支架材料上，體外培養(yǎng)3天后自體回植于動物皮下，4周后取出支架材料，制作石蠟切片采用免疫組化法鑒定BrdU標記的脂肪干細胞在體內(nèi)標記的效果。 結(jié)果：兔脂肪干細胞體外培養(yǎng)具有成纖維細胞樣外形，增埴迅速，連續(xù)傳代14代細胞形態(tài)無明顯改變，無自發(fā)性向脂肪細胞分化現(xiàn)象。成脂誘導12天后油紅O染色胞漿內(nèi)發(fā)現(xiàn)紅染的油滴，成骨誘導14天后Von kossa染色陽性，由此證明在體外定向誘導后脂肪干

4、細胞可以向脂肪細胞和成骨細胞分化。BrdU可標記脂肪干細胞的核，采用10μmol/L的BrdU體外標記48小時是適宜的標記方法，該方法對脂肪干細胞的增殖無明顯影響。初測標記率達95％，標記率隨傳代次數(shù)而降低，傳代8次(約體外培養(yǎng)4周)后標記率仍達41％。同期進行的體內(nèi)實驗證實，BrdU標記后的脂肪干細胞移植入體內(nèi)4周后免疫組化檢測有BrdU陽性細胞存在，從而證明移植的脂肪干細胞可以在體內(nèi)存活。 結(jié)論：兔脂肪干細胞易于體外分離培