前列腺癌組織膽堿攝取值與其腫瘤生物學行為相關性的初步研究.pdf

1、第一部分，前列腺癌組織膽堿攝取值與其腫瘤生物學行為相關性的初步研究
　　 研究背景及目的：
　　 惡性腫瘤細胞的分裂增生非常旺盛，因而細胞膜的生物合成也非?；钴S。理論上，作為細胞膜構成上的重要組分的膽堿在體內的攝取、代謝情況可以反映腫瘤組織細胞的增殖情況，從而與其腫瘤生物學行為相關。經同位素11C標記的膽堿也因此被發(fā)展成為一種核醫(yī)學檢查的示蹤劑，用于對惡性腫瘤的診斷與鑒別診斷。然而該法在臨床實際應用于初診前列腺癌顯像過程

2、時，膽堿在惡性腫瘤組織中的標準攝取值(standarduptakevalue，SUV)往往個體差異非常大，且其數值往往受多種因素影響，甚至單憑膽堿攝取值難以有效鑒別前列腺良惡性病變，因此關于其在前列腺癌診斷中的意義存在爭議。有鑒于此，在本項研究中，我們應用11C_膽堿PET/CT技術對前列腺癌進行顯像中，同時記錄前列腺癌病灶膽堿最大SUV值(SUVmax)以及同層臀大肌SUVmax值，以后者為背景計算其比值SUVmax-P/M值。以SU

3、Vmax及SUVmax-P/M值作為描述前列腺癌病灶膽堿攝取的指標，分析其與患者腫瘤病理分級、分期以及多個腫瘤生物學行為分子標記物表達情況的相關性，探討膽堿攝取在前列腺癌發(fā)生發(fā)展中的意義，并進一步評估11C-膽堿核素顯像技術在前列腺癌的診治中的應用價值。
　　 研究方法：
　　 1.病例資料共計26例于2007年四月-2010年三月接受11C_膽堿PET/CT的前列腺癌患者納入本項研究，均經超聲引導下的經直腸前列腺穿刺組

4、織活檢術證實為前列腺癌。26例患者平均年齡67.1歲，按照AJCC(2002)標準進行臨床分期，其中Ⅱ期患者10例，Ⅲ期患者5例，Ⅳ期患者11例。Gleason積分平均7.2±1.3，7(4+3)分及以上者14例。所有患者在接受PET/CT檢查前均未行雄激素阻斷治療以及其他任何有創(chuàng)性操作，前列腺組織活檢于PFT/CT檢查完成后進行，且以PET/CT顯像結果為參照，對可疑病灶區(qū)域予以重點穿刺取樣，留取前列腺癌組織標本。
　　 2.

5、11C_膽堿PET/CT顯像及數據分析11C-膽堿的制備由GEMINItrace回旋加速器生產11C，采用固相一步法全自動方法合成11C-膽堿?；颊哂陟o脈注射7.4MBq/kg11C-膽堿5分鐘后行仰臥位PET/CT顯像。行4排螺旋CT掃描后，PET采用2D掃描，采集2個床位（盆腔），可疑轉移患者采集6個床位（全身）。PET數據經OSEM重建，通過Xeleris工作站進行圖像融合分別得到冠狀、矢狀、橫斷的CT、PET及PET/CT融合圖

6、像。
　　 在前列腺病灶濃聚灶部位按病灶形狀勾畫感興趣區(qū)(regionofinterest，ROI)，計算并記錄出該部位的最大標準攝取值(SUVmax);同法在病灶同層面臀大肌測量SUVmax，并計算其與前列腺病灶SUVmax的比值即SUVmax-P/M值。
　　 3.免疫組織化學檢測前列腺組織石蠟切片經脫蠟、水化、高溫抗原修復后，按照Envision二步法對Ki-67、雄激素受體、CD31、Her-2/neu、PTEN

7、和Bcl-2進行免疫組織化學染色，并對結果予以定量/半定量評分或定性評價。
　　 4.統(tǒng)計學分析將11C-膽堿PET/CT結果，包括前列腺病灶SUVmax以及SUVmax-P/M值，與患者臨床病理資料及免疫組化檢測結果的關系以SPSS17.0進行統(tǒng)計學分析。
　　 研究結果：
　　 1.26例患者前列腺癌病灶SUVmax值平均為9.42±6.70(1.69-24.65)，SUVmax-P/M值平均為4.33±1.

8、41(1.18-7.44)。如以SUVmax-P/M值2.3為診斷前列腺癌的界值，其診斷敏感度為88.6％。Ⅱ期與Ⅲ期患者間SUVmax值與SUVmax-P/M值均無顯著的統(tǒng)計學差異，但兩者在Ⅳ期患者中均顯著升高。Spearman等級相關分析顯示SUVmax值與SUVmax-P/M值與Gleason積分均無明顯相關性，但是在Gleason積分7分(4+3)及以上的患者組的SUVmax-P/M值顯著的高于Gleason積分7分(3+4)及

9、以下的患者組，而兩組的SUVmax值無明顯差異。
　　 2.26例患者以Ki-67標記增殖指數平均為10.4±13.1(0-48)，以CD31標記計算微血管密度(MVD)平均為26.4±11.8(7-48)，雄激素受體半定量評分平均為86.5±61.8(0-180)。Spearman等級相關分析顯示SUVmax-P/M值與增殖指數、MVD值均具有統(tǒng)計學相關性，而與雄激素受體表達情況無明顯相關;SUVmax值則與上述指標均無相關性

10、。26例患者中判定為Her-2/neu，Bcl-2及PTEN表達陽性的患者分別為6例，13例及11例。其中Her-2/neu表達陽性的患者SUVmax-P/M值明顯高于陰性的患者，具有統(tǒng)計學差異。Bcl-2及PTEN表達呈陽性及陰性組間SUVmax-P/M值無明顯差異。SUVmax值在此3個指標表達陽性及陰性組中均無明顯差異。
　　 研究結論：
　　 以同層肌肉SUVmax值校正后的前列腺癌病灶膽堿攝取值SUVmax-P

11、/M值與前列腺癌患者的臨床分期、Gleason積分以及Ki-67等指標表達間均有一定的相關性，能較好反映前列腺癌的腫瘤生物學行為。以SUVmax-P/M值作為描述前列腺癌組織膽堿攝取情況的指標，可為前列腺癌患者臨床分期、腫瘤惡性程度、治療方案選擇以及預后估計等多個方面提供有益信息，具有很高的臨床應用價值。
　　 第二部分，鈣調蛋白拮抗劑小檗胺抗前列腺癌作用機制的體內外實驗研究
　　 研究背景及目的：
　　 前列腺

12、癌是目前西方國家男性最為常見的惡性腫瘤之一,近年來隨著我國生活水平的上升和飲食生活習慣的西化,前列腺癌的發(fā)病率也在快速上升,現已位居泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤發(fā)病率的第三位,但與西方不同,我國大多數前列腺癌患者就診時譯處于晚期,無法行手術根治性切除,只能采用內分泌治療為主的藥物治療。其機理主要是通過阻斷阻斷雄激素分泌以及對抗雄激素作用,從而抑制受雄激素促進的腫瘤細胞增殖、以及誘導雄激素依賴性腫瘤細胞發(fā)生凋亡,達到抑制腫瘤生長的目的。但是多數患者會

13、在內分泌治療開始后2-3年內轉變成去勢抵抗性前列腺癌(CRPC),此時則已有內分泌治療手段即開始宣告失效。另一方面,目前化療藥物對前列腺癌效果均不理想,因而尋找新的抗前列腺癌藥物顯得十分必要。
　　 鈣調蛋白是一種生理功能調節(jié)劑,在細胞生長增殖過程中起重要作用。在惡性增殖的細胞中,鈣調蛋白的含量和活性均高出正常細胞。鈣調蛋白可與雄激素受體直接結合,兩者在結構和功能上密切相關。體外實驗發(fā)現,給予鈣調蛋白拮抗劑可顯著抑制雄激素受體陽

14、性的前列腺癌細胞系的增殖及誘導凋亡,其作用效能類似抗雄激素藥物。但是,目前已有的鈣調蛋白拮抗劑,如W7、三氟拉嗪等藥物對人體不良反應較大,難以廣泛應用于臨床前列腺癌的治療。
　　 小檗胺是從我國中草藥小檗屬植物中提取的的一種雙芐基異喹啉類生物堿,被廣泛用于治療各種原因尤其是腫瘤放化療引起的白細胞減少癥已有數十年,安全有效、價格低廉是其突出的優(yōu)勢。而通過對小檗胺的化學結構進行分析發(fā)現該藥物亦屬鈣調蛋白拮抗劑。我們課題組以往的研究發(fā)

15、現小檗胺在體外可有效抑制前列腺癌細胞增殖,并可通過上調bax基因、下調survivin基因的表達誘導前列腺癌細胞發(fā)生凋亡,并推測該藥物對不同前列腺癌細胞系的作用活性的差異可能與其鈣調蛋白含量有關。以此為基礎,本研究以不同雄激素受體表達情況的細胞系為研究目標,進一步探討小檗胺體外抗前列腺癌作用的機制,并對其體內抗前列腺癌作用的效能進行評估,以期為小檗胺應用于前列腺癌的臨床藥物治療提供實驗和理論依據。
　　 研究方法：
　　

16、 1.小檗胺抗前列腺癌作用機制的體外實驗研究選擇雄激素依賴性且雄激素受體陽性表達的前列腺癌細胞系LNCAP、雄激素非依賴性但雄激素受體弱陽性表達細胞系CWR22RV1以及雄激素非依賴性且雄激素受體陰性細胞系PC3進行體外培養(yǎng),取對數生長期細胞用于實驗研究。MTT法檢測不同濃度小檗胺對此三種細胞系細胞活力的影響,計算增殖抑制率及IC50；流式細胞術檢測小檗胺對三種細胞系細胞周期的影響。Caspase-3/8/9活性檢測試劑盒測定小檗胺對L

17、NCAP、PC3細胞相應Caspase凋亡酶活性的影響,以推測其可能介導的凋亡通路。Western-blotting法檢測小檗胺對LNCAP、PC3細胞Fas蛋白、雄激素受體表達情況的影響。
　　 2.小檗胺對前列腺癌細胞體內作用的研究實驗4-6周齡雄性balb-c/nu-nu裸小鼠24只,飼養(yǎng)于SPF環(huán)境中,分別于背部皮下接種相應對數生長期CWR22RV1細胞混懸液0.2毫升,細胞計數約107個。待前列腺癌細胞皮下移植成瘤后,

18、隨機分為小檗胺處理與對照組,處理組為按60mg/kg體重每日腹腔注射小檗胺溶液,對照組以等劑量生理鹽水注射,每周測量、計算移植瘤體積,描繪生長曲線。處理4周后處死裸小鼠,切取移植瘤脫水、浸蠟,制作石蠟切片,以TUNEL法檢測凋亡情況,計算凋亡指數(AI)；免疫組織化學法檢查PCNA表達情況以反映移植瘤細胞增殖情況。
　　 研究結果：
　　 小檗胺對LNCAP、CWR22RV1及PC3細胞均顯示出明顯的抑制增殖作用,抑制作

19、用以對LNCAP細胞最強,而對PC3細胞作用最弱,且均呈明顯的劑量依賴性。LNCAP、CWR22RV1及PC3細胞的48小時IC50分別為為15.06μg/ml、31.49μg/ml及37.04μg/ml。流式細胞術檢測顯示小檗胺處理后LNCAP細胞G1期細胞顯著增多,而S期及G2期細胞減少,而CWR22RV1細胞及PC3細胞則均出現了S期阻滯,尤以PC3阻滯于S期的細胞比例為高。Caspase酶活性分析顯示小檗胺處理后LNCAP及PC

20、3細胞均出現不同程度的Caspase-3/8/9活性升高,尤其LNCAP細胞出現了顯著強于PC3細胞的Caspase-8的活性升高,提示經小檗胺處理后,兩種細胞均存在內源性凋亡通路激活,而LNCAP同時出現了比更為顯著的外源性凋亡通路的激活,這可能是LNCAP細胞對小檗胺更為敏感的原因。Western-blotting檢測發(fā)現小檗胺處理后LNCAP細胞Fas蛋白表達明顯升高,而PC3細胞未查見類似變化；同時LNCAP細胞在經過40μg/

21、ml小檗胺處理48小時后細胞內雄激素受體水平出現明顯下降。
　　 體內實驗24只裸小鼠皮下接種CWR222RV1細胞均獲得成功,估算移植瘤體積達約100mm3后即隨機編入小檗胺處理組及對照組進行藥物干預。結果顯示,小檗胺處理組移植瘤生長速度顯著慢于對照組。實驗期間裸小鼠無意外死亡,藥物干預結束后剖取移植瘤,稱重計算移植瘤抑制率達45.1％。TUNEL法檢測移植瘤細胞凋亡率,對照組平均為4.7%,小檗胺處理組則為21.2%；免疫組

22、織化學法檢測移植瘤PCNA表達,對照組平均為78.8%,小檗胺處理組則為40.9%,組間均具有顯著的統(tǒng)計學差異。
　　 研究結論：
　　 本研究結果提示小檗胺在體外對多種前列腺癌細胞系均具有增殖抑制作用,且其活性與細胞表達雄激素受體情況一致。小檗胺處理使雄激素依賴性前列腺癌細胞周期阻滯于G1期,而雄激素非依賴性前列腺癌細胞細胞周期阻滯于S期。小檗胺對雄激素依賴性及非依賴性前列腺癌細胞均可激活內源性凋亡通路,而在雄激素依賴