巨頜癥致病基因SH3BP2突變體對(duì)成纖維細(xì)胞的增殖抑制作用研究.pdf

1、巨頜癥(cherubism，MIM118400)于1933年首次被美國(guó)學(xué)者Jones進(jìn)行報(bào)道。為一種罕見的疾病，是由良性頜骨發(fā)育不良導(dǎo)致的，典型癥狀為雙側(cè)頜骨的對(duì)稱性腫大。頜骨腫大是由于過度吸收的骨組織被炎性纖維結(jié)締組織替代，從而導(dǎo)致嚴(yán)重的面部畸形。典型的病變一般開始于2-5歲的兒童，發(fā)生骨吸收和面部腫脹，持續(xù)到青春期，在大多數(shù)病例青春期以后病變自發(fā)靜止，此后也可自行修復(fù)。但是也有少數(shù)患者病變并不停止?；颊叱０橛醒腊l(fā)育異常，導(dǎo)致咬合關(guān)系

2、紊亂，影響患者語言、吞咽、咀嚼和呼吸等功能，有的還可引起阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征，嚴(yán)重者可同時(shí)累及上頜骨，擴(kuò)展至眼眶引起復(fù)視、視力減退等并發(fā)癥。加之，研究已經(jīng)證實(shí)，該病為常染色體顯性遺傳性疾病，故巨頜癥的預(yù)防及理想的生物學(xué)治療方法研究便成了眾多學(xué)者密切關(guān)注和一直致力探索的目標(biāo)，這也成了本課題組關(guān)注的研究目標(biāo)。
　　已有研究確定位于染色體4p16.3區(qū)域的SH3BP2基因?yàn)榫揞M癥的致病基因。目前已發(fā)現(xiàn)十幾種突變類型，大多數(shù)突變位于S

3、H3BP2基因第9外顯子上，僅有兩例位于第3、4外顯子，突變的堿基使其編碼的蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，導(dǎo)致巨頜癥的發(fā)生。于2006年本課題組首先報(bào)道了一種新的點(diǎn)突變，為第9外顯子上基因編碼區(qū)第1256位堿基堿基由A突變?yōu)镚，導(dǎo)致其編碼的蛋白由Asp突變?yōu)镚ly。
　　SH3BP2編碼的蛋白是一種接頭蛋白，最早是通過掃描小鼠的包含有Sre同源3結(jié)構(gòu)域(Srehomology3domain，SH-3)融合蛋白的cDNA文庫時(shí)被發(fā)現(xiàn)的。巨頜癥

4、的頜骨骨組織過度吸收為巨頜癥的一大特點(diǎn)，有研究者報(bào)道，當(dāng)其表達(dá)在小鼠單核細(xì)胞系Raw264.7中被敲低后，Raw264.7分化為成熟的破骨細(xì)胞的過程障礙，提示它在破骨細(xì)胞的分化過程中起重要作用。巨頜癥中的SH3BP2突變蛋白能夠上調(diào)破骨前體細(xì)胞對(duì)破骨細(xì)胞分化因子(receptoractivorofNF-Kbligand，RANKL)和巨噬細(xì)胞集落刺激因子(macrophagecolony-stimulatingfactors，M-CSF

5、)的應(yīng)答，表明其為功能獲得型突變。SH3BP2還能調(diào)節(jié)活化破骨細(xì)胞分化所必需的轉(zhuǎn)錄因子T細(xì)胞核因子1蛋白(NFATc1)的活性;多數(shù)SH3BP2堿基替換突變的蛋白不與14-3-3伴侶蛋白結(jié)合，從而可以持續(xù)發(fā)揮刺激破骨細(xì)胞分化的功能。巨頜癥中被破壞的骨組織被增生性炎癥纖維組織替代，因此局部頜骨纖維化也是巨頜癥的重要組織學(xué)特點(diǎn)，而該過程中成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)可能受到單核-巨噬細(xì)胞等調(diào)控，但這種調(diào)控是否受SH3BP2的影響目前尚不清楚。明確這

6、些問題，有助于了解SH3BP2突變?nèi)绾螀⑴c巨頜癥結(jié)締組織反應(yīng)，為探討緩解癥狀和患者面部畸形的生物干預(yù)方法提供理論支持。
　　第一部分突變型SH3BP2真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其穩(wěn)定過表達(dá)Raw264.7細(xì)胞系的建立
　　目的:為了實(shí)現(xiàn)體外研究巨頜癥致病基因SH3BP2點(diǎn)突變導(dǎo)致的功能改變，明確其纖維異常增生的發(fā)生機(jī)制，體外建立SH3BP2突變(c.1256A＞G)突變體的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。
　　方法:采用定點(diǎn)突變方法，成功構(gòu)

7、建了巨頜癥致病基因SH3BP2突變(c.1256A＞G)真核表達(dá)載體，通過測(cè)序予以鑒定;用野生型和突變型真核表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)染單核細(xì)胞系Raw264.7，通過G418篩選過表達(dá)穩(wěn)定株，挑取單克隆細(xì)胞團(tuán)并擴(kuò)增;用Westernblott和RealtimePCR技術(shù)檢測(cè)蛋白的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:(1)突變質(zhì)粒構(gòu)建通過BLAST比對(duì)，除第1256位堿基，SH3BP2測(cè)序結(jié)果與NM_003023SH3BP2蛋白翻譯區(qū)核酸序列一致，第125

8、6位堿基已成功由A突變?yōu)镚，與本課題組之前報(bào)道突變型SH3BP2序列相一致;
　　(2)轉(zhuǎn)染真核過表達(dá)載體并G418篩選后的克隆團(tuán)，體積小而圓，野生型和突變型SH3BP2過表達(dá)的Raw264.7細(xì)胞外形無明顯差異。WesternBlott和RealtimePCR結(jié)果均顯示:相對(duì)于未轉(zhuǎn)染組，野生型、突變型SH3BP2基因轉(zhuǎn)染組中各有8個(gè)克隆SH3BP2蛋白表達(dá)水平明顯增高，P＜0.01。
　　結(jié)論:(1)本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了突變型

9、(c.1256A＞G)SH3BP2真核表達(dá)載體;
　　(2)成功建立了穩(wěn)定過表達(dá)突變型(p.Asp419Gly)和野生型SH3BP2的Raw264.7細(xì)胞系。
　　第二部分SH3BP2突變體對(duì)成纖維細(xì)胞增殖抑制作用的研究
　　目的:用突變型和野生型Raw264.7過表達(dá)穩(wěn)定株條件培養(yǎng)基，培養(yǎng)小鼠頜骨及長(zhǎng)骨成纖維細(xì)胞。用兩組穩(wěn)定株的條件培養(yǎng)基探討巨頜癥突變的破骨細(xì)胞前體細(xì)胞的旁分泌對(duì)頜骨及長(zhǎng)骨骨髓基質(zhì)中的成纖維樣細(xì)胞增殖

10、的影響。
　　方法:分別制備突變型和野生型Raw264.7過表達(dá)穩(wěn)定株條件培養(yǎng)基，培養(yǎng)P2代4W雄性BALB/c小鼠頜骨來源成纖維樣細(xì)胞和長(zhǎng)骨來源的成纖維細(xì)胞，CCK-8試劑盒檢測(cè)兩種成纖維細(xì)胞增殖曲線。
　　結(jié)果:過表達(dá)突變型蛋白組的條件培養(yǎng)基中成纖維細(xì)胞減少速率小于野生型組(P＜0.05)。兩種條件培養(yǎng)基對(duì)頜骨成纖維細(xì)胞增殖抑制作用均強(qiáng)于長(zhǎng)骨成纖維細(xì)胞。
　　結(jié)論:與過表達(dá)野生型SH3BP2的單核細(xì)胞相比，過表達(dá)突