積雪甙對(duì)造模小鼠成纖維細(xì)胞抑制作用光鏡電鏡觀察的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、1.目的： 本研究擬從動(dòng)物模型中，探討積雪甙治療炎癥后成纖維細(xì)胞修復(fù)的作用機(jī)理，通過對(duì)光鏡和電鏡的觀察了解在炎癥發(fā)展過程中成纖維細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)的改變，為積雪甙在臨床廣泛應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。 2.實(shí)驗(yàn)材料： 2.1藥物與試劑：積雪甙，上?，F(xiàn)代浦東藥廠有限公司生產(chǎn)，批號(hào)050401，規(guī)格6mg/片；四環(huán)素，成都景華削藥廠生產(chǎn)，批號(hào)050302，規(guī)格0.25g/片；痤瘡丙酸桿菌，由澳大利亞細(xì)菌實(shí)驗(yàn)室提供；10％甲

2、醛溶液，由武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理免疫室提供；2.5％戊二醛由武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院電鏡室提供。 2.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：昆明純系小鼠40只，雌雄各半，體重28±2g，鼠齡2個(gè)月，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供。 2.3儀器：光電雙目顯微鏡1臺(tái)，由武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫病理實(shí)驗(yàn)室提供；細(xì)胞計(jì)數(shù)器1個(gè)，由武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫病理實(shí)驗(yàn)室提供。LKB2V型超薄切片機(jī)，日立H2600型透射電鏡由武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院電鏡實(shí)驗(yàn)室提供。 3.方法：

3、 3.1痤瘡丙酸桿菌培養(yǎng)：凍干痤瘡丙酸桿菌以腦心浸液溶解后，室溫下放置數(shù)分鐘，取少許溶液培養(yǎng)于5％血液瓊脂，厭氧環(huán)境下35-37℃培養(yǎng)5-7天，用生理鹽水洗滌3次，調(diào)整痤瘡丙酸桿菌濃度為2×1010/ml備用。并經(jīng)鏡下檢驗(yàn)確定為藍(lán)色棒狀桿菌。 3.2造模：小鼠背部剪毛，約1×1厘米大小，每只小鼠三處，將已培養(yǎng)的痤瘡丙酸桿菌生理鹽水稀釋兩次后接種注射到小鼠的皮下，每一點(diǎn)注射2000萬單位痤瘡丙酸桿菌，注射后每日觀察小鼠局部皮膚

4、的變化。(《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)技術(shù)》中國(guó)中醫(yī)藥出版社256) 3.3分組：將40只實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為四組，積雪甙+四環(huán)素組；積雪甙組；四環(huán)素組；空白對(duì)照組；每組10只。 3.4灌胃：在造模后第7天，積雪甙+四環(huán)素組給予積雪甙混懸液0.25ml(0.144mg/ml)和四環(huán)素混懸液0.25ml(1.5mg/ml)灌胃。積雪甙組給予積雪甙混懸液0.25ml(0.144mg/ml)灌胃。四環(huán)素組給予四環(huán)素混懸液0.25ml(1.

5、5mg/ml)灌胃?？瞻讓?duì)照組給予生理鹽水0.25ml灌胃。按規(guī)定劑量于每日上午8-10時(shí)給藥。(《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)》湖北科學(xué)技術(shù)出版社277常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及人的體表面積比例表) 3.5光鏡標(biāo)本制作及觀察：在造模后第3、7、10、14、21天切除小鼠皮膚，10％甲醛固定，按石蠟切片常規(guī)處理，用HE染色，在光鏡下觀察接種部位成纖維細(xì)胞造模后顯微結(jié)構(gòu)的改變，并在低倍鏡下，用測(cè)微尺計(jì)數(shù)成纖維細(xì)胞總數(shù)。 3.6.電鏡標(biāo)本制作及觀察：在造

6、模后第3、7、14、21天切除小鼠皮膚，2.5％戊二醛前固定，1％鋨酸固定，梯度乙醇脫水，樹脂包埋，半薄切片定位，LKB2V型超薄切片機(jī)切片，日立H2600型透射電鏡觀察，觀察接種部位成纖維細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器結(jié)構(gòu)的變化。 3.7統(tǒng)計(jì)方法：治療前后成纖維細(xì)胞的計(jì)數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。 4.結(jié)果： 局部接種注射后，第2天觀察四組小鼠，可見接種部位皮膚明顯腫脹，第3天光鏡觀察：表皮及真皮內(nèi)炎細(xì)胞彌漫性浸潤(rùn)，以大量嗜中性白細(xì)胞為主

7、，部分為單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，組織水腫明顯，肌間隙及肌層中炎細(xì)胞浸潤(rùn)。第7天時(shí)成纖維細(xì)胞呈星形突起，細(xì)胞較大，大部分胞質(zhì)嗜堿性，細(xì)胞核呈橢圓形，細(xì)胞大部分分布在膠原纖維周圍，可見細(xì)胞排列密集，數(shù)量多，功能活躍，膠原纖維含量豐富。四組之間差別不大。第10天開始，積雪甙+四環(huán)素組的成纖維細(xì)胞由星形突起變?yōu)楸鈾E圓形，細(xì)胞變小，炎性細(xì)胞明顯減少。第14天，第21天局部接種部位成纖維細(xì)胞呈梭形，細(xì)胞較小，胞質(zhì)弱嗜堿性，細(xì)胞核呈扁平狀，顏色深，細(xì)胞大

8、部分分布在膠原纖維之間，細(xì)胞數(shù)量隨實(shí)驗(yàn)時(shí)間延長(zhǎng)而減少，其功能不活躍，膠原纖維含量較少，已基本無炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。積雪甙組從第10天開始成纖維細(xì)胞逐漸變小，細(xì)胞呈梭形，細(xì)胞核呈扁平狀，細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，第21天仍有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。四環(huán)素組炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，第14天時(shí)仍有少量炎癥細(xì)胞，21天時(shí)已基本無炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，成纖維細(xì)胞數(shù)量仍較多，排列密集，大量膠原纖維增生。空白對(duì)照組第14天，21天真皮內(nèi)膠原纖維大量增生，呈旋渦狀或結(jié)節(jié)狀分布，結(jié)節(jié)

9、中的膠原纖維較細(xì)，并分布有較多數(shù)量不等的成纖維細(xì)胞和小血管等。電鏡觀察：積雪甙+四環(huán)組3天：成纖維細(xì)胞內(nèi)可見大量的初級(jí)溶酶體和豐富的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；積雪甙+四環(huán)素組7天：成纖維細(xì)胞內(nèi)有豐富的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，游離核糖體及豐富的高爾基復(fù)合體，線粒體腫脹明顯；積雪甙+四環(huán)素組第14天成纖維細(xì)胞內(nèi)線粒體腫脹明顯減輕，少量的高爾基復(fù)合體，少量的游離的核糖體。積雪甙+四環(huán)素組21天：成纖維細(xì)胞胞體較小，周圍突起較少，胞質(zhì)內(nèi)可見少量粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，高爾基復(fù)合體，

10、游離核蛋白體不發(fā)達(dá)。 5.結(jié)論： 纖維性結(jié)節(jié)，增生性瘢痕，萎縮性瘢痕是炎癥感染愈合過程中可能或必然的產(chǎn)物。皮膚炎癥感染后愈合，是人體自衛(wèi)體系的一個(gè)重要組成部分。在皮膚炎癥感染愈合過程中，因受全身因素和局部因素的影響而形成程度不同纖維增生性疾病如纖維性結(jié)節(jié)，增生性瘢痕或萎縮性瘢痕。纖維性結(jié)節(jié)，是由于皮膚炎癥感染后，成纖維細(xì)胞包裹炎癥感染灶，逐漸發(fā)展而成纖維性結(jié)節(jié)。由于成纖維細(xì)胞繼續(xù)增殖，分泌膠原蛋白，并影響其合成代謝，超過

11、分解代謝的速度，在一定時(shí)間內(nèi)，大量形成膠原纖維，在臨床癥狀上表現(xiàn)為增生性瘢痕或纖維性結(jié)節(jié)。膠原纖維形成的數(shù)量和速度與成纖維細(xì)胞的生物學(xué)活性有著重要的關(guān)系。積雪甙是一種中藥積雪草提取物。痤瘡?？崎T診曾對(duì)積雪甙在臨床上治療伴有結(jié)節(jié)性損害的痤瘡中的療效進(jìn)行觀察。發(fā)現(xiàn)在痤瘡結(jié)節(jié)早期，采用積雪甙片聯(lián)合抗菌藥物治療，由于積雪甙能使結(jié)節(jié)周圍的纖維成分減少，從而增加了抗菌藥物的抗菌能力，使其易于達(dá)到目標(biāo)靶位。同時(shí)，減少了炎性結(jié)節(jié)愈合留下的纖維性結(jié)節(jié)，提

12、高了結(jié)節(jié)消退率和臨床治愈率。對(duì)炎癥后纖維性結(jié)節(jié)，單獨(dú)使用積雪甙片亦可收到較好的臨床效果[10]。但均未見相關(guān)的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究相關(guān)的報(bào)道。我們查閱了大量文獻(xiàn)，設(shè)計(jì)了積雪甙聯(lián)合抗生素對(duì)炎癥感染愈合過程組織中成纖維細(xì)胞數(shù)量和形態(tài)的變化的基礎(chǔ)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，積雪甙+四環(huán)素組局部接種部位組織中成纖維細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞形態(tài)由功能活躍的星形突起逐漸成為梭形和扁平狀，其胞質(zhì)嗜堿性減弱，細(xì)胞內(nèi)合成蛋白質(zhì)的細(xì)胞器減少，膠原纖維數(shù)量減少，排列松散。