pPCP1質(zhì)粒上小RNAHmsA對鼠疫菌生物膜形成和毒力的分子調(diào)控機制研究.pdf

1、廣義上講，調(diào)節(jié)小RNA(small regulatory RNAs，以下簡稱“小RNA”)是指能調(diào)節(jié)基因表達(dá)或蛋白活性的所有細(xì)菌RNA分子，編碼位置可為基因間區(qū)、mRNA反義鏈或5'或3'非翻譯區(qū)（UTR），長度通常在50-500nt之間，靶分子可以是mRNA或蛋白質(zhì)。由于其多數(shù)不翻譯成蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)錄后即可發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，與蛋白類調(diào)節(jié)子相比，sRNA存在長度和反應(yīng)時間上的優(yōu)勢，一旦合成或降解，迅速發(fā)揮或終止調(diào)節(jié)作用，屬于細(xì)菌的一種節(jié)能調(diào)控方

2、式。小RNA通常在與特定靶標(biāo)mRNA的核糖體結(jié)合位點或其附近序列結(jié)合，干擾核糖體行為或影響mRNA穩(wěn)定性，或與蛋白質(zhì)直接結(jié)合，影響蛋白質(zhì)活性，在轉(zhuǎn)錄后和翻譯水平發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，可參與細(xì)菌多種生理過程如生物膜形成、應(yīng)激反應(yīng)、致病等。根據(jù)與靶分子的位置關(guān)系和作用方式，分為順式和反式作用兩種類型小RNA。反式作用小RNA半數(shù)以上需要RNA結(jié)合蛋白Hfq的輔助才能發(fā)揮作用。
　　鼠疫耶爾森氏菌（Yersinia pestis,以下簡稱鼠疫菌

3、）為革蘭氏陰性菌，是一種自然疫源性疾病的病原菌，引發(fā)宿主高致死性疾病——鼠疫。鼠疫菌通常只在動物間傳播，引起動物間鼠疫的流行，嚙齒類動物是鼠疫耶爾森氏菌的貯存宿主，鼠蚤是其主要傳播媒介。然而，人類偶然感染鼠疫菌通常是被感染的跳蚤叮咬或是直接與患畜接觸而引起的，臨床上常見的鼠疫有三種類型：腺鼠疫、肺鼠疫和敗血癥型鼠疫。鼠疫菌能夠在鼠蚤前胃中形成生物膜是鼠疫菌能夠在鼠蚤體內(nèi)生存并且在宿主間傳播的重要原因，也是鼠疫菌能夠從假結(jié)核耶爾森氏菌進(jìn)化

4、而來的關(guān)鍵。調(diào)節(jié)蛋白參與的鼠疫菌生物膜形成的調(diào)控機制方面，目前已經(jīng)取得了諸多進(jìn)展。前期研究結(jié)果提示，鼠疫菌的小RNA很可能參與鼠疫菌的生物膜調(diào)控與致病。然而，單個小RNA是否和如何參與鼠疫菌中生物膜形成的調(diào)控有待更多的研究。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)：小RNA HmsA是一個鼠疫菌pPCP1質(zhì)粒編碼的高豐度小RNA。pPCP1質(zhì)粒是鼠疫菌在進(jìn)化過程中外源獲得的一個質(zhì)粒，該質(zhì)粒對鼠疫菌生物膜形成和毒力的獲得可能發(fā)揮重要作用。本研究旨在探究小RN

5、A HmsA對鼠疫菌生物膜形成和毒力的影響及其可能的機制。
　　依據(jù)鼠疫菌轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，小RNA HmsA位于鼠疫菌pPCP1質(zhì)?；蚪M的9435-9500位堿基上，本研究首先通過Northern blotting實驗驗證了小RNA HmsA的存在、大小，并使用引物延伸方法確定了HmsA的精確轉(zhuǎn)錄起始位點。利用同樣的方法比較了鼠疫菌野生型菌株(WT)和hfq突變株中的HmsA豐度差異，證實了HmsA的Hfq依賴性。通過North

6、ern blotting實驗的方法比較了鼠疫菌WT和crp突變株中的HmsA豐度差異，證明了CRP調(diào)節(jié)蛋白能調(diào)控HmsA的表達(dá)。使用λ-Red同源重組方法構(gòu)建小RNA HmsA的缺失突變株(hmsA)，并測定了鼠疫菌的野生型菌株(WT)與hmsA的生長曲線沒有明顯差異，提示小RNA HmsA不影響鼠疫菌的生長。在此基礎(chǔ)上，將小RNA HmsA的過表達(dá)質(zhì)粒（pBAD-HmsA）導(dǎo)入到hmsA中，構(gòu)建過表達(dá)菌株(hmsA:HmsA)。通過N

7、orthern blotting實驗，驗證HmsA在鼠疫菌WT、hmsA以及誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)?hmsA:HmsA菌株中的表達(dá)量。結(jié)果證實了誘導(dǎo)后的?hmsA:HmsA菌株中HmsA的表達(dá)量顯著高于其他菌株。
　　為探究HmsA是否在鼠疫菌生物膜形成的調(diào)控中發(fā)揮作用，我們通過三種經(jīng)典的生物膜形成檢測方法（褶皺、結(jié)晶紫和線蟲實驗），比較鼠疫菌WT、?hmsA和?hmsA:HmsA的生物膜形成能力。鼠疫菌菌落表面褶皺實驗觀察并比較不同菌株在

8、固體培養(yǎng)基上生長時菌落表面的褶皺形成情況，結(jié)果表明WT和阿拉伯糖誘導(dǎo)的?hmsA:HmsA菌株菌落表面褶皺形成明顯強于?hmsA；結(jié)晶紫染色實驗對不同菌株菌膜形成進(jìn)行定量分析，結(jié)果表明WT和?hmsA:HmsA菌株菌膜量明顯高于?hmsA；而線蟲蟲卵發(fā)育實驗比較了不同菌株在線蟲體內(nèi)形成栓塞致蟲卵的發(fā)育能力，結(jié)果表明WT和?hmsA:HmsA菌株在線蟲體內(nèi)栓塞形成能力明顯強于?hmsA。此外，我們還測定了不同菌株中胞內(nèi)c-di-GMP的濃

9、度，結(jié)果表明WT和?hmsA:HmsA菌株中c-di-GMP的濃度明顯高于?hmsA。以上實驗證明了小RNA HmsA能夠促進(jìn)鼠疫菌生物膜的形成及c-di-GMP的合成。以上結(jié)果均提示，HmsA可能促進(jìn)鼠疫菌生物膜的形成。此外，我們還利用小鼠攻毒實驗分析了HmsA對鼠疫菌毒力的影響。將鼠疫菌的WT和?hmsA菌株分別以靜脈、腹腔和皮下注射的途徑感染小鼠并計算小鼠的生存曲線，三種感染途徑的攻毒實驗結(jié)果都顯示，感染?hmsA的小鼠死亡時間略

10、早于WT感染小鼠，表明?hmsA菌株的毒力強于WT菌株，提示小RNA HmsA可能抑制鼠疫菌的毒力。
　　上述實驗已經(jīng)證實，小RNA HmsA促進(jìn)鼠疫菌生物膜的形成，并抑制鼠疫菌的毒力。為了進(jìn)一步探究其可能的分子機制，我們采用了引物延伸、Northern blotting、qRT-PCR和β-半乳糖苷酶報告基因融合（LacZ）等實驗，檢測了野生株和ΔhmsA突變株HmsA對生物膜相關(guān)基因或操縱子（hmsHFRS、hmsCDE、hm

11、sT、hmsP、小RNA HmsB）和毒力相關(guān)基因或操縱子（psaABC、psaEF、fur、rovA、rovM基因）的豐度或轉(zhuǎn)錄活性變化。實驗結(jié)果顯示，缺失了hmsA后，hmsHFRS操縱子、rovM基因和小RNA HmsB的轉(zhuǎn)錄活性和豐度下降，提示HmsA可以通過間接作用正調(diào)控這些基因的表達(dá)。半衰期的測定實驗結(jié)果提示HmsA可能影響小RNA HmsB的穩(wěn)定性。類似地，HmsA可能間接在轉(zhuǎn)錄水平上負(fù)調(diào)控rovA基因和psaABC、ps

12、aEF操縱子，但不調(diào)控hmsP和fur基因。然而，hmsA的缺失引起hmsT和hmsCDE轉(zhuǎn)錄水平的下降，并不影響的其轉(zhuǎn)錄活性，推測HmsA對hmsT和hmsCDE的調(diào)控可能發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平上。考慮到小RNA的調(diào)控多數(shù)發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平上，通過上述實驗初步篩選小RNA HmsA直接作用的候選靶標(biāo)。
　　為了驗證小RNA HmsA的直接靶標(biāo)基因，我們引入了低拷貝的gfp報告基因融合載體（pXG-10-SF），該翻譯融合載體在大腸桿菌中

13、已被較好的用來篩選和驗證小RNA的直接靶標(biāo)基因。于是我們選擇了經(jīng)典的sRNA-靶基因mRNA對—MicF-ompF，來驗證該系統(tǒng)在鼠疫菌中的應(yīng)用，并進(jìn)一步篩選小RNA HmsA的直接靶標(biāo)基因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鼠疫菌中過表達(dá)的小RNA MicF能調(diào)節(jié)ompF基因報告基因融合載體上GFP熒光蛋白的表達(dá)，提示該報告系統(tǒng)能用于指示sRNAs介導(dǎo)的mRNA調(diào)節(jié)。然而，鼠疫菌野生株中MicF正調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)ompF，與大腸桿菌中負(fù)調(diào)節(jié)的結(jié)果相反。當(dāng)鼠疫菌4個固

14、有質(zhì)粒缺失后，調(diào)節(jié)方向恢復(fù)，提示鼠疫菌中自身質(zhì)粒影響小RNA MicF介導(dǎo)的對ompF基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。我們最終證實了鼠疫菌的pPCP1質(zhì)?？赡苁怯绊懶NA MicF介導(dǎo)的對ompF基因的轉(zhuǎn)錄后抑制的主要因素。因此，我們以MicF-ompF為模型，建立了基于gfp報告基因融合載體的鼠疫菌中小RNA直接靶標(biāo)基因篩選系統(tǒng)，但是在我們研究小RNA介導(dǎo)的基因調(diào)控時需要考慮鼠疫菌自身質(zhì)粒的影響。隨后我們通過gfp報告基因融合載體實驗對小RNA

15、HmsA的多個靶標(biāo)基因（hmsHFRS、hmsCDE、hmsT、hmsP、fur、psaABC、psaEF、rovA、rovM基因）進(jìn)行了篩選，最終實驗結(jié)果顯示，HmsA過表達(dá)與否影響到hmsT的翻譯水平，提示hmsT基因可能是小RNA HmsA的直接靶標(biāo)基因，具體的結(jié)合機制還有待于進(jìn)一步探討。
　　總之，這是首次嘗試研究鼠疫菌外源獲得質(zhì)粒上的小RNA對鼠疫菌生物膜形成和致病的影響。本研究的實驗結(jié)果證實：pPCP1質(zhì)粒編碼的小RN

16、A HmsA促進(jìn)鼠疫菌生物膜形成的同時，能夠抑制鼠疫菌的毒力，提示小RNA HmsA可能在鼠疫菌由假結(jié)核耶爾森氏菌進(jìn)化獲得生物膜形成能力和毒力的過程中發(fā)揮一定的作用。我們篩選了HmsA可能調(diào)節(jié)的生物膜或毒力相關(guān)基因，有助于加深我們對小RNA參與鼠疫菌生物膜形成和毒力調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中的認(rèn)識。然而，小RNA HmsA通過哪些關(guān)鍵的直接靶標(biāo)基因調(diào)控，還需要更多實驗來證明。此外，鼠疫菌的pPCP1質(zhì)粒能夠影響小RNA介導(dǎo)的靶基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)，提示我們