PHC CTL表位肽微粒疫苗的構(gòu)建及機(jī)理研究.pdf

1、【目的】為探索有效的以表位為基礎(chǔ)的抗肝癌疫苗構(gòu)建策略,在確定針對(duì)肝癌的CTL表位疫苗設(shè)計(jì)是否適宜的基礎(chǔ)之上,從肝癌細(xì)胞表達(dá)的優(yōu)勢(shì)抗原中尋找和確定能用于CTL疫苗構(gòu)建的免疫優(yōu)勢(shì)CTL表位,然后選擇合適的載體和佐劑制備CTL表位肽疫苗,并在體外初步研究其特性和免疫學(xué)活性,以及免疫作用機(jī)制,為有效疫苗的制備和改進(jìn)提供依據(jù),并為最終臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ).【方法】采用免疫組織化學(xué)LSAB法研究人肝癌組織MHC-Ⅰ類(lèi)途徑重要相關(guān)分子和CTL表位肽疫苗研

2、究模型細(xì)胞株靶抗原h(huán)AFP的表達(dá)情況;運(yùn)用該室建立的HLA-A2限制性CTL表位綜合預(yù)測(cè)程序A2B和國(guó)外權(quán)威預(yù)測(cè)網(wǎng)站的預(yù)測(cè)程序,綜合預(yù)測(cè)評(píng)估源自AFP的HLA-A2限制性CTL表位,從中篩選出可能自然產(chǎn)生和遞呈的候選免疫優(yōu)勢(shì)CTL表位;固相法人工合成候選表位肽,并以反相高效液相色譜和質(zhì)譜純化鑒定;通過(guò)T2細(xì)胞結(jié)合實(shí)驗(yàn)和CTL殺傷分析檢測(cè)候選表位肽與HLA-A2分子的親和力和體外特異性CTL誘導(dǎo)能力,以確定候選表位是否是能自然產(chǎn)生和遞呈的

3、免疫優(yōu)勢(shì)CTL表位;以PLA為載體和佐劑,用溶劑揮發(fā)法和非溶劑沉淀法制備載肽的PLA免疫微球和免疫片粒,激光粒徑分析儀和掃描電子顯微鏡分別檢測(cè)其平均粒徑大小和形態(tài),并用紫外分光光度法測(cè)定免疫微粒的包封率和載藥量以及免疫微粒的體外釋放;體外CTL誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)免疫微粒特異性CTL誘導(dǎo)能力:考察單核-巨噬細(xì)胞對(duì)微粒的吞噬作用、微粒對(duì)巨噬細(xì)胞的毒性及活化作用,以了解微粒與巨噬細(xì)胞的相互作用和微粒免疫活性的基礎(chǔ);應(yīng)用胞內(nèi)抑制劑阻斷抗原遞呈的MHC

4、-Ⅰ類(lèi)途徑相關(guān)過(guò)程,以探索PLA免疫微粒細(xì)胞遞呈的可能機(jī)制.【結(jié)論】1.該室保種的人肝癌細(xì)胞Alexander、HepG-2可用于以hAFP為靶抗原的肝癌CTL表位肽疫苗研究;2.絕大多數(shù)原發(fā)性肝細(xì)胞癌細(xì)胞可能能被特異性CTL所識(shí)別和殺傷,以AFP為靶抗原進(jìn)行肝癌CTL表位肽疫苗的設(shè)計(jì)和構(gòu)建切實(shí)可行;3.絕大多數(shù)原發(fā)性肝細(xì)胞癌組織MHC-Ⅰ類(lèi)遞呈途徑可能完好,提示腫瘤的免疫逃逸可能與抗原遞呈后的事件有關(guān),肝癌患者機(jī)體可能處于免疫耐受或免

5、疫抑制狀態(tài);4.該室開(kāi)發(fā)的HLA-A2限制CTL表位綜合預(yù)測(cè)程序A2B和網(wǎng)絡(luò)相關(guān)資源可用于表位綜合預(yù)測(cè)評(píng)估,減少研究工作的盲目性,提高成功率;5.候選表位肽hAFP<,156-166>和hAFP<,218-226>具有與HLA-A2分子較高的親和力和較強(qiáng)的特異性CTL誘導(dǎo)能力,并能自然產(chǎn)生和遞呈,是HLA-A2限制的優(yōu)勢(shì)CTL表位:6.hAFP<,156-166>和hAFP<,18-226>可能具有超型意義;7.應(yīng)用PLA可以制備得到研

6、究所需要的具有良好特性的免疫微粒:8.免疫微球的體外釋放特性與片粒明顯不同,其免疫作用也可能不同;9.本室制備的四種PLA免疫微粒在體外都具有較強(qiáng)的、誘導(dǎo)對(duì)表達(dá)靶抗原肝癌細(xì)胞特異性殺傷CTL的能力,可能是一種有效的腫瘤CTL表位肽疫苗形式,特別是PLA免疫片粒;10.免疫微粒能為人單核-Mφ細(xì)胞高效吞噬和有效遞呈,誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性細(xì)胞免疫;11.免疫微?？赏ㄟ^(guò)在胞外釋放表位肽,直接與細(xì)胞表面MHC-Ⅰ類(lèi)分子結(jié)合而遞呈;12.免疫微粒還可通