益氣活血法抗乳腺癌血道轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)與臨床轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、乳腺癌是嚴(yán)重威脅婦女生命健康的常見惡性腫瘤。乳腺癌的轉(zhuǎn)移直接威脅患者生存。中醫(yī)藥在抗乳腺癌轉(zhuǎn)移中療效肯定?；仡櫸墨I(xiàn)報(bào)道，乳腺癌血瘀證與乳腺癌的血道轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。但是學(xué)界對(duì)腫瘤活血化瘀藥的運(yùn)用存在爭議：怎么用、用多少、為什么，莫衷一是。導(dǎo)師孫桂芝教授從事中西結(jié)合腫瘤治療近半個(gè)世紀(jì)，認(rèn)為氣虛、血瘀、毒凝是乳腺癌轉(zhuǎn)移的根本病機(jī)。乳腺癌血瘀證具有腫瘤血瘀證的通性，也有其自身特性，臨床施治當(dāng)整體把握，區(qū)別對(duì)待，活血藥運(yùn)用當(dāng)配合益氣藥。根據(jù)既往自然

2、基金研究結(jié)果，結(jié)合多年臨證經(jīng)驗(yàn)，導(dǎo)師總結(jié)出抗乳腺癌轉(zhuǎn)移的“益氣活血方”：黃芪、蘇木、蜂房、蒲黃、炮山甲?；趯?dǎo)師學(xué)術(shù)思想，本課題對(duì)“益氣活血方”抗乳腺癌血道轉(zhuǎn)移的療效、機(jī)制、運(yùn)用進(jìn)行深入、系統(tǒng)的研究。
　　1目的：
　　導(dǎo)師學(xué)術(shù)思想研究：系統(tǒng)總結(jié)導(dǎo)師治療乳腺癌經(jīng)驗(yàn)。
　　基礎(chǔ)研究：獲得“益氣活血方”的最佳配伍“益氣活血核心方”，核心方臨床運(yùn)用適宜劑量。從乳腺癌血道轉(zhuǎn)移中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)變、血管新生兩大核心環(huán)節(jié)探討導(dǎo)師抗乳腺癌

3、血道轉(zhuǎn)移學(xué)術(shù)思想的科學(xué)內(nèi)涵。
　　臨床轉(zhuǎn)化研究：制定乳腺癌血瘀證量化診斷標(biāo)準(zhǔn)，并與基礎(chǔ)研究進(jìn)行理論銜接，為導(dǎo)師學(xué)術(shù)思想的臨床運(yùn)用提供技術(shù)支持。
　　2方法：
　　導(dǎo)師學(xué)術(shù)思想研究：跟隨導(dǎo)師臨證，按照中醫(yī)理論對(duì)導(dǎo)師治療乳腺癌經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行總結(jié)。
　　基礎(chǔ)研究：采用乳腺癌小鼠荷瘤模型，篩選抗乳腺癌體內(nèi)增殖作用最強(qiáng)的“益氣活血核心方”，采用含藥血清藥理學(xué)方法，獲得核心方抗乳腺癌細(xì)胞體外增殖適宜劑量。采用體外體內(nèi)相結(jié)合的方法，

4、從TGF-β/Smad通路介導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)變和血管新生角度，探討核心方抗乳腺癌血道轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。
　　臨床轉(zhuǎn)化研究：采用臨床流行病學(xué)、計(jì)量統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，研究乳腺癌血瘀證量化診斷標(biāo)準(zhǔn)，并以JAVA編程實(shí)現(xiàn)判別過程的自動(dòng)化?；诹炕瘶?biāo)準(zhǔn)判別，檢測血瘀證與非血瘀證乳腺癌患者血清TGF-β水平差異，與基礎(chǔ)研究銜接。
　　3結(jié)果：
　　3.1孫桂芝教授治療乳腺癌辨證、遣方、用藥規(guī)律分析。
　　導(dǎo)師治療乳腺癌的主要特色有：辯證

5、論治，以證選方；辨病論治，病證結(jié)合；參照科研，精細(xì)用藥；重視經(jīng)絡(luò)，回歸傳統(tǒng)。治療重點(diǎn)為扶正、疏肝、活血、理氣、解毒。對(duì)于乳腺癌發(fā)生的肺轉(zhuǎn)移、骨轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移、腦轉(zhuǎn)移，運(yùn)用益氣活血法，并結(jié)合臟器自身生理特性予以施治。特色鮮明，療效卓著。
　　3.2基礎(chǔ)研究。
　　3.2.1益氣活血方最佳組合的拆方研究。
　　益氣活血方中“黃芪、蘇木、蜂房、炮山甲”成分，對(duì)乳腺癌EMT6細(xì)胞的BALB/C小鼠體內(nèi)增殖抑制作用最強(qiáng)，與對(duì)照組差

6、異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P<0.05。定名為“益氣活血核心方”。
　　3.2.2益氣活血核心方適宜劑量的探索。
　　CCK-8法檢測“益氣活血核心方”不同濃度含藥血清，不同作用時(shí)間，在體外對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞活力抑制情況?！包S芪30g、蘇木6g、蜂房6g、炮山甲6g”臨床經(jīng)驗(yàn)劑量為基礎(chǔ)，2倍用量抑制腫瘤細(xì)胞增殖作用最佳，為推薦劑量。4倍及以下劑量可抑制腫瘤細(xì)胞增殖的，為適宜劑量。6倍劑量作用72小時(shí)，具有一定的促進(jìn)腫瘤增殖的作用

7、，P<0.05，9倍劑量在24、48、72小時(shí)均可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，P<0.05，為不推薦劑量。
　　3.2.3益氣活血核心方適宜劑量抗小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移的研究。
　　確定益氣活血核心方2倍臨床劑量具有抗4T1細(xì)胞BALB/C小鼠體內(nèi)肺轉(zhuǎn)移的作用，抑制率為58.82％，P<0.05，較紫杉醇組65.88％為優(yōu)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0.05。
　　3.2.4益氣活血核心方抗乳腺癌血道轉(zhuǎn)移的實(shí)驗(yàn)研究.

8、　　3.2.4.1益氣活血核心方抗乳腺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)變的研究。
　　以TGF-β2ng/ml誘導(dǎo)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞發(fā)生的EMT為體外模型。發(fā)現(xiàn)益氣活血核心方對(duì)乳腺癌EMT進(jìn)程中細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變、侵襲和轉(zhuǎn)移能力的增強(qiáng)具有一定的抑制作用。并能抑制此過程中E-鈣粘素等上皮細(xì)胞標(biāo)志分子的下調(diào)及N-鈣粘素等間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志分子的上調(diào)。
　　報(bào)告基因技術(shù)結(jié)合實(shí)時(shí)定量PCR發(fā)現(xiàn)，核心方可抑制Smad分子入核，降低TGF-β/Smad通路激活，

9、減少及其下游轉(zhuǎn)錄因子SNAIL。
　　對(duì)血清TGF-β水平檢測發(fā)現(xiàn)，益氣活血核心方能夠降低4T1乳腺癌荷瘤小鼠血清中TGF-β水平，特別對(duì)晚期荷瘤小鼠血清TGF-β水平的爆發(fā)性增高具有抑制作用，P<0.05，但是較紫杉醇的作用為弱。
　　3.2.4.2氣活血核心方抗乳腺癌局部新生血管生成的實(shí)驗(yàn)研究。
　　以冰凍切片免疫熒光的方法發(fā)現(xiàn)，益氣活血核心方適宜劑量對(duì)腫瘤邊緣和內(nèi)部新生血管具有一定的抑制作用(P<0.05)。進(jìn)一

10、步PCR法檢測血管生成相關(guān)細(xì)胞因子，發(fā)現(xiàn)可能與其下調(diào)腫瘤細(xì)胞表達(dá)VEGF-A、VEGF-D有關(guān)。
　　3.3臨床轉(zhuǎn)化研究.
　　通過對(duì)乳腺癌病歷資料Logistic回歸、條件概率換算、ROC曲線判別、前瞻新檢驗(yàn)，獲得乳腺癌血瘀證量化診斷標(biāo)準(zhǔn)。診斷閾值16分。診斷標(biāo)準(zhǔn)敏感度95.0％、特異度81.8％、準(zhǔn)確度90.3％、陽性似然比5.225、陰性似然比6.11％，檢驗(yàn)性能優(yōu)良。開發(fā)出乳腺癌血瘀證診斷自動(dòng)化軟件。
　　以新

11、制定的乳腺癌血瘀證量化診斷標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)血瘀證乳腺癌患者血清中TGF-β水平較非血瘀證患者為高，P<0.05。
　　4.結(jié)論：
　　孫桂芝抗乳腺癌經(jīng)驗(yàn)方最佳組合“益氣活血核心方”具有抗乳腺癌血道轉(zhuǎn)移的作用，與阻斷Smad分子入核與靶基因啟動(dòng)子結(jié)合，抑制TGF-β/Smad通路介導(dǎo)的乳腺癌EMT進(jìn)程，同時(shí)阻斷乳腺癌局部血管新生的機(jī)制有關(guān)。
　　結(jié)合乳腺癌血瘀證量化診斷標(biāo)準(zhǔn)及孫桂芝教授治療乳腺癌經(jīng)驗(yàn)，益氣活血核心方可按劑量推薦

12、在臨床使用。
　　孫桂芝教授益氣活血法抗乳腺癌血道轉(zhuǎn)移學(xué)術(shù)思想具有豐富的理論內(nèi)涵和科學(xué)內(nèi)涵，值得學(xué)習(xí)、繼承、研究和發(fā)揚(yáng)。
　　5.主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)：
　　5.1采用現(xiàn)代生物信息學(xué)和分子生物學(xué)前沿技術(shù)，體內(nèi)外試驗(yàn)相結(jié)合，通過對(duì)益氣活血核心方抑制乳腺癌細(xì)胞增殖，抗乳腺癌血道轉(zhuǎn)移及其機(jī)制研究。首次揭示了益氣活血法抗乳腺癌治則、治法科學(xué)內(nèi)涵，為傳承與挖掘名老中醫(yī)經(jīng)驗(yàn)提供了新思路。
　　5.2研究發(fā)現(xiàn)促轉(zhuǎn)移活性因子TGF-β在晚