羅格列酮對OLETF鼠糖尿病發(fā)病機制中IKK-NF-κB通路作用的初步研究.pdf

1、隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展和人們生活方式的改變,2型糖尿病(Type2 diabetesmellitus,T2DM)已經(jīng)成為嚴重危害人類健康的慢性非傳染性疾病。
　　 羅格列酮(Rosiglitazone,RSG)作為一種新型的噻唑烷二酮類(Thiazolidinediones,TZDs)胰島素增敏劑,在臨床上已廣泛應用于胰島素抵抗和T2DM的治療。探討羅格列酮從胰島素抵抗和炎癥角度對T2DM發(fā)病干預作用的可能機制。具體研究分為以下兩個

2、部分:
　　 第一章羅格列酮對OLETF鼠胰島素作用的靶器官-肝臟及胰腺的形態(tài)學影響[目的]通過觀察羅格列酮對自發(fā)性T2DM大鼠模型OLETF鼠胰島素作用的靶器官-肝臟及胰腺的形態(tài)學影響,探討羅格列酮對T2DM發(fā)病的干預作用。
　　 [方法]
　　 1.以自發(fā)性T2DM大鼠模型OLETF鼠和其同系非糖尿病對照鼠LETO鼠為實驗對象。
　　 2.分別于8周齡、32周齡和40周齡隨機(玻璃珠法)處死大鼠。大鼠

3、宰殺后分離肝臟及胰腺組織,并分別置于10％多聚甲醛中待檢。
　　 3.以石蠟切片機間隔4um連續(xù)切片。相鄰切片分別用標準HE染色觀察大鼠肝臟及胰腺組織學改變。
　　 4.特殊染色:根據(jù)HE結果,對32周齡及40周齡的對照組及干預組大鼠肝臟以冰凍切片進行脂肪蘇丹Ⅲ染色及淀粉酶消化前后的PAS染色,以進一步明確病變性質(zhì)。
　　 [結果]
　　 1.8周齡時,各組大鼠胰島結構無明顯差別。32周齡,干預組和對照組

4、胰島明顯比LETO組肥大,并有纖維組織長入,對照組大鼠胰島纖維化更加明顯,胰島結構不整齊。40周齡,對照組大鼠胰島形狀更不規(guī)則,纖維組織大量增生,多數(shù)胰島失去正常結構,胰島明顯萎縮。干預組大鼠胰島基本保持正常結構,無明顯肥大或萎縮,部分胰島有內(nèi)外分泌腺交錯生長或明顯的纖維化。
　　 2.8周齡時,各組大鼠肝臟結構亦無明顯差別。32周齡,對照組及干預組大鼠肝細胞均出現(xiàn)明顯空泡樣變性,而LETO組大鼠肝小葉結構依然整齊,肝細胞以中央

5、靜脈為中心排列成索狀。40周齡,對照組大鼠肝細胞空泡樣變性更加明顯,干預組較32周時改善,仍可見部分肝細胞空泡化。
　　 3.蘇丹Ⅲ染色結果:32周齡,干預組及對照組肝細胞均出現(xiàn)明顯的脂肪變性,其中對照組肝細胞以小泡性脂肪變性為主,而干預組則為大小泡混合性脂肪變性,同時可見大量脂滴沉積于膽小管中；40周齡時,干預組脂肪變性明顯減輕,膽小管中脂滴沉積亦減少,而對照組進一步發(fā)展為大小泡混合性脂肪變性。
　　 4.淀粉酶消化前

6、后的糖原特殊染色--PAS染色結果:32周齡,PAS染色對照組及干預組肝細胞的胞質(zhì)及胞核均可見豐富的紅色顆粒,經(jīng)過淀粉酶消化后PAS染色陰性,證明紅色顆粒均為糖原顆粒；40周齡,對照組肝細胞中紅色顆粒更加豐富,而干預組肝細胞中紅色顆粒明顯減少,經(jīng)淀粉酶消化后染色陰性證實為糖原。
　　 [結論]
　　 1.羅格列酮能夠通過保護OLETF大鼠胰島及肝臟的正常形態(tài)結構,達到維持胰島素作用的靶器官的生理功能作用；
　　

7、2.OLETF大鼠肝臟隨著糖尿病病程進展,脂肪浸潤及糖原累積逐漸加重；
　　 3.羅格列酮的短期應用,對改善OLETF大鼠肝臟的脂肪浸潤及糖原累積影響不大；長期應用,可改善OLETF大鼠肝臟的脂肪及糖原堆積。
　　 第二章羅格列酮對OLETF鼠IKK/NF-κB通路的影響[目的]通過羅格列酮的早期干預,觀察羅格列酮對OLETF鼠IKK/NF-κB通路的影響以及胰島素敏感性相關指標的影響,從抗炎角度探討羅格列酮對改善OLE

8、TF鼠胰島素抵抗的影響及其機制。
　　 [方法]
　　 1.實驗動物、分組和干預措施同第一部分2.取液氮中的肝臟及胰腺標本,提取總蛋白,以免疫印跡(Westernblot,WB)方法測量組織中IKKβ的蛋白表達情況,凝膠圖像分析系統(tǒng)觀察結果,檢測各組目標蛋白條帶的灰度值,并計算目標條帶與內(nèi)參β-actin條帶的灰度比值,觀察IKKβ的蛋白表達情況3.取第一部分中已處理的各組大鼠的肝臟和胰腺組織蠟塊,以石蠟切片機間隔4um

9、連續(xù)切片。相鄰切片用免疫組化法標記NF-κB陽性細胞,用凝膠圖像分析系統(tǒng)觀察結果,用陽性單位(PositiveUnit,PU)表示NF-κB在各組大鼠肝臟及胰腺的表達情況。
　　 4.同法,石蠟切片機連續(xù)切片后,相鄰切片用免疫組化法標記IRS-1陽性細胞,通過凝膠圖像分析系統(tǒng),用PU表示IRS-1在各組大鼠肝臟及胰腺的表達情況。
　　 5.分析IKKβ、NF-κB及IRS-1的相關性6.實驗數(shù)據(jù)計量資料以均數(shù)±標準差((

10、x)±s)。采用SPSS10.0軟件進行統(tǒng)計分析,兩樣本間計量資料的比較采用t檢驗。多組間資料比較采用單因素方差分析(ANOVA)檢驗。各因子之間的雙變量相關性采用等級相關系數(shù)(Spearman秩相關系數(shù))的非參數(shù)方法。
　　 [結果]
　　 1、羅格列酮對OLETF大鼠肝臟中IKKβ表達的影響
　　 2、羅格列酮對OLETF大鼠胰腺中IKKβ表達的影響
　　 3、羅格列酮對大鼠肝臟NF-κB表達的影響干

11、
　　 4、羅格列酮對OLETF鼠胰腺NF-κB表達的影響
　　 5、羅格列酮對大鼠肝臟IRS-1表達的影響
　　 6、羅格列酮對OLETF鼠胰腺IRS-1表達的影響
　　 7、肝臟中IKKβ、NF-κB與IRS-1的相關性分析
　　 8、胰腺中IKKβ、NF-κB與IRS-1的相關性分析
　　 [結論]
　　 1.羅格列酮早期干預能降低OLETF鼠IKKβ、NF-κB的表達,從炎

12、癥啟動的上游因子開始減輕炎癥反應對胰島素作用的靶器官肝臟和胰腺的損害。
　　 2.羅格列酮早期干預能顯著增加OLETF鼠肝臟及胰腺組織中IRS-1的表達水平,可能是其改善胰島素抵抗的機制之一。
　　 3.OLETF鼠肝臟中IKKβ表達與NF-κB的陽性單位在各周齡時均呈高度正相關(P<0.001)；與IRS-1陽性單位呈負相關,其中32周齡和40周齡時相關性有統(tǒng)計學意義(P<0.02)。在胰腺組織中有同樣的趨勢。驗證了I