塵螨、過氧化氫對人支氣管上皮細胞表達血管內(nèi)皮生長因子的影響及機制研究.pdf

1、支氣管哮喘(簡稱哮喘)是一種嚴重影響人類健康的慢性呼吸道疾病。研究顯示,全球哮喘病人約3億,我國約有3000萬哮喘患者,而且有不斷增加的趨勢。哮喘是基因與環(huán)境因素共同導致的復雜疾病,盡管經(jīng)由GINA推薦的規(guī)范化治療方案可以讓大部分患者得到有效控制,但依然不能改變哮喘的自然病史。同時全球哮喘的規(guī)范化治療及哮喘控制率距GINA的目標還相差甚遠。我國的哮喘診治率非常不樂觀,加上現(xiàn)有的哮喘治療藥物價格偏高,很多患者無法承受巨大的醫(yī)療支出,這也使

2、得哮喘的規(guī)范化治療陷入了困境,同時目前對哮喘確切的致病機制仍然不清楚,因此探討哮喘發(fā)病機制、尋找新的治療靶點仍然是呼吸專業(yè)關(guān)注的重要課題。
　　 氣道上皮細胞(AEC),作為氣道抵抗外來刺激的第一道防線,在固有免疫中發(fā)揮著重要的作用。近年來也證實,AEC是哮喘固有免疫與獲得性免疫聯(lián)系的橋梁,在多種哮喘觸發(fā)因素作用下,AEC釋放多種炎性介質(zhì),與免疫、炎性細胞及氣道結(jié)構(gòu)細胞發(fā)生廣泛的聯(lián)系,參與哮喘的發(fā)生、發(fā)展?，F(xiàn)在認為:AEC在哮喘

3、氣道炎癥的啟動和維持中扮演關(guān)鍵角色。
　　 哮喘中存在著免疫失衡,多種細胞因子參與了其發(fā)生、發(fā)展。因此,探討引發(fā)炎癥失衡的關(guān)鍵細胞因子會給哮喘的防治帶來新的曙光。有研究通過轉(zhuǎn)基因動物實驗表明,阻斷血管內(nèi)皮生長因子(VEGF),能使哮喘的氣道炎癥、氣道重塑、氣道高反應件等病理生理變化趨于正常化。本課題組前期研究已經(jīng)證實VEGF在職業(yè)相關(guān)因素甲苯二異氰酸鹽(TDI)誘導AEC通透性的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。上述均提示VEGF可能成為哮喘

4、防治的重要靶點。
　　 哮喘的觸發(fā)因素很多,塵螨是自然界導致哮喘發(fā)生的最常見的致敏原,而且有動物實驗也證實利用塵螨刺激能夠成功建立哮喘動物模型。但是塵螨導致哮喘的發(fā)生、發(fā)展的確切機制目前仍不明確,需要深入探討。
　　 研究已經(jīng)證實哮喘存在氧化還原的失衡,氧化應激與哮喘發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān),涉及哮喘自然病史、氣道炎癥、氣道高反應性但機制仍不清楚。因此,探討哮喘中的氧化應激機制有可能為哮喘的防治提供新的靶點。
　　 鑒

5、于塵螨及氧化應激在哮喘發(fā)病中的重要的作用,本實驗將在前期研究基礎上選擇VEGF為主要檢測指標,利用體外AEC研究模型,探討塵螨、過氧化氫刺激下HBE表達VEGF的影響及機制,試圖為哮喘的發(fā)病機制及治療靶點提供新的實驗依據(jù)。
　　 課題第一部分:標準化屋塵螨制劑(安脫達(R)SQ)對人支氣管上皮細胞(16-HBE)表達血管內(nèi)皮生長(VEGF)的影響及可能機制
　　 方法:
　　 1、購買標準化塵螨制劑(安脫達(R)

6、SQ)。
　　 2、四唑鹽(MTT)比色法檢測不同標準化塵螨制劑(以下簡稱塵螨)濃度對16-HBE活力的影響,分組情況:正常對照組,塵螨100U/L組,塵螨200U/L組,塵螨400U/L組,塵螨600U/L組,塵螨800U/L組,塵螨1000U/L組,塵螨2000U/L組。
　　 3、觀察不同濃度塵螨對16-HBE VEGF基因表達的影響,分組情況:正常對照組,塵螨200U/L組,塵螨400U/L組,塵螨600U/L組

7、,塵螨800U/L組,塵螨1000U/L組。按上述刺激24h后,收集細胞培養(yǎng)上清,并提取總RNA,應用Real time-PCR檢測16-HBE的VEGF基因表達情況。
　　 4、選取對VEGF升高最明顯的塵螨濃度400U/L,預先加入PI3K特異阻斷劑LY294002處理45min,濃度為10μmol/L,并設單獨加入LY294002(10μmol/L)組,上述刺激24h后收集細胞培養(yǎng)上清,并提取總RNA,應用Real tim

8、e-PCR檢測16-HBE的VEGF基因表達情況。
　　 5、應用酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)法檢測上述細胞培養(yǎng)上清中VEGF蛋白表達情況。
　　 6、統(tǒng)計學方法:采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析,計量資料用均數(shù)±標準差表示,方差齊時,總體均數(shù)的比較采用單向方差分析(one-way ANOVA),各組間多重比較采用LSD法,方差不齊時總體均數(shù)的比較采用Welkch法,各組間多重比較采用Dunnett’s T3法檢驗,以

9、P<0.05具有統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)論:標準化塵螨制劑在不影響細胞活力的情況下,在一定濃度范圍內(nèi)能夠在基因和蛋白水平上調(diào)16-HBE VEGF(165)的表達,以400U/L濃度時最顯著,且能夠被PI3K通路特異阻斷劑LY294002所抑制。提示標準化塵螨制劑可PI3K通路依賴地上調(diào)16-HBE VEGF基因和蛋白的表達。
　　 第二部分:過氧化氫對人支氣管上皮細胞表達VEGF的影響及可能機制
　　 方法:

10、r>　　 1、觀察不同濃度的過氧化氫(H2O2)對正常人支氣管上皮細胞16-HBE細胞活力影響:分組如下:正常對照組、H2O2(10μmol/L)組、H2O2(50μmol/L)組、H2O2(100μmol/L)組、H2OO2(200μmol/L)組、H2O2(300μmol/L)組、H2O2(400μmol/L)組、H2O2(500μmol/L),按上述分組刺激16-HBE 12小時后,用MTT比色法檢測細胞活力。
　　 2

11、、觀察不同濃度H2O2及PI3K通路特異性阻斷劑LY294002對16-HBE表達VEGF基因的影響:實驗分成7組:正常對照組、H2O2(50μmol/L)組、H2O2(100μmol/L)組、H2O2(150μmol/L)組、H2O2(200μmol/L)組、H2O2(100μmol/L)+LY294002(10μmol/L)組、LY294002(10μmol/L)組。按上述分組刺激16-HBE 12小時后,收集細胞上清并提取細胞總R

12、NA,應用Real time-PCR檢測16-HBE的VEGF基因表達情況。
　　 3、觀察不同濃度的N-乙酰半胱氨酸(NAC)對正常人支氣管上皮細胞16-HBE細胞活力影響:分組如下:正常對照組、NAC(10mmol/L)組、NAC(20mmol/L)組、NAC(50mmol/L)組,按上述分組刺激16-HBE12小時后,用四唑鹽(MTT)比色法檢測細胞活力。
　　 4、觀察不同濃度NAC作用下H2O2(100umol

13、/L)對16-HBE表達VEGF基因的影響:實驗分為8組:正常對照組、NAC(10mmol/L)組、NAC(20mmol/L)組、NAC(50mmol/L)組、H2O2(100μmol/L)組、H2O2(100μmol/L)+NAC(10mmol/L)、H2O2(100μmol/L)+NAC(20mmol/L)組、H2O2(100μmol/L)+NAC(50mmol/L)組,按上述分組刺激16-HBE12小時后,收集細胞上清并提取細胞總

14、RNA,應用Real time-PCR檢測16-HBE的VEGF基因表達情況。
　　 5、應用酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)法檢測上述細胞培養(yǎng)上清中VEGF蛋白表達情況。
　　 6、統(tǒng)計學方法:采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析,計量資料用均數(shù)士標準差(X±S)表示,方差齊時,總體均數(shù)的比較采用單向方差分析(one-wayANOVA),各組間多重比較采用LSD法,方差不齊時總體均數(shù)的比較采用Welkch法,各組間多重比較采

15、用Dunnett’s T3法檢驗。以P<0.05具有統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)論:
　　 過氧化氫(H2O2)在不影響細胞活力的情況下,在一定濃度范圍內(nèi)能在基因和蛋白水平上調(diào)16-HBE VEGF(165)的表達,以H2O2(100μmol/L)時最顯著,且能夠被PI3K通路特異阻斷劑LY294002所抑制,過氧化氫可經(jīng)由PI3K通路上調(diào)16-HBE VEGF的表達。NAC在不影響細胞活力的情況下能夠逆轉(zhuǎn)由過氧化氫導致的16