雙歧桿菌CMS-H004株加重潰瘍性結(jié)腸炎損傷的研究及其抗體的制備.pdf

1、第一章：雙歧桿菌CMS-H004株加重UC損傷的實(shí)驗(yàn)研究。 目的：在前期研究發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌CMS-H004株有加重UC損傷作用的基礎(chǔ)上，用多株雙歧桿菌比較的方法，驗(yàn)證是否CMS-H004株具有加重UC損傷的株特異性。 方法： Balb/c小鼠70只，隨機(jī)分為7組：1)正常組；2)模型組；3)陰性對(duì)照(NS組)；4)陽性對(duì)照(5-ASA組)；5)CMS-H004組：6)PFK組；7)JSQ組。5％DSS溶液自由飲用7

2、天造成小鼠急性潰瘍性結(jié)腸炎模型，通過觀察、檢測小鼠癥狀、體征、疾病活動(dòng)度評(píng)分、病理組織學(xué)評(píng)分、電鏡結(jié)構(gòu)、結(jié)腸長度、腸道菌群分析、髓過氧化物酶活性、腫瘤壞死因子濃度等指標(biāo)，評(píng)估雙歧桿菌CMS-H004株與培菲康、金雙歧中的雙歧桿菌菌株對(duì)DSS誘導(dǎo)的UC的影響。 結(jié)果： 雙歧桿菌CMS-H004株能夠明顯加重DSS誘導(dǎo)的UC模型損傷。其相當(dāng)于人類UC的臨床表現(xiàn)項(xiàng)目如：體重下降、隱血、血便及死亡時(shí)間等出現(xiàn)得最早，便血率、死亡率

3、最高，疾病的DAI積分最高，粘膜損傷的病理學(xué)改變也最嚴(yán)重，結(jié)腸MPO活性最高，與其它各組比較有顯著性差異(P<0.05)。PFK、JSQ菌株以上各項(xiàng)損傷指標(biāo)均沒有DSS組嚴(yán)重。飲用DSS后腸道乳酸桿菌數(shù)目減少，擬桿菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌明顯增加，腸球菌、雙歧桿菌和總需氧菌無明顯變化；CMS-H004組菌群變化與模型組相似，其雙歧桿菌數(shù)目并未增加。 結(jié)論： 1)在結(jié)腸粘膜有損傷的基礎(chǔ)上，雙歧桿菌CMS-H004株能夠

4、加重黏膜損傷； 2)DSS可使腸道乳酸桿菌減少，而不影響雙歧桿菌數(shù)量；應(yīng)用雙歧桿菌CMS-H004株與其相似，但并不增加腸道雙歧桿菌。 第二章：雙歧桿菌CMS-H004株加重UC損傷的機(jī)理研究。 目的：從炎癥因子、緊密連接、防御素不同角度體內(nèi)、體外初步探討雙歧桿菌CMS-H004株加重UC損傷的機(jī)理。 方法： Balb/c小鼠45只，隨機(jī)分為3大組、9小組：N3、N5、N7是正常組第3、5、7天：

5、M3、M5、M7是DSS模型組飲用DSS后第3、5、7天；B3、B5、B7是CMS-H004菌株灌腸組飲用DSS后第3、5、7天。5％：DSS溶液自由飲用7天造成小鼠急性潰瘍性結(jié)腸炎模型。RT-PCR和免疫印跡法檢測不同時(shí)間點(diǎn)結(jié)腸組織IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)；免疫印跡法檢測不同時(shí)間點(diǎn)結(jié)腸緊密連接蛋白.ZO-1和β-防御素-2蛋白質(zhì)的表達(dá)。 體外培養(yǎng)HT-29細(xì)胞，與雙歧桿菌CMS-H004株、P

6、FK株共孵育1小時(shí)后用TNF-α刺激3小時(shí)，檢測其上清LDH含量和NF-K B轉(zhuǎn)錄入細(xì)胞核的數(shù)目。 結(jié)果： 1)飲用DSS誘導(dǎo)損傷后IL-1β、IL-6、TNF-α均開始有表達(dá)，但CMS-H004組在飲用DSS第3天后出現(xiàn)表達(dá)，而模型組是在飲用DSS第5天后出現(xiàn)，同一時(shí)間點(diǎn)CMS-H004組IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)量高于模型組，正常組幾乎不表達(dá)以上炎癥因子。 2)正常組小鼠結(jié)腸高表達(dá)ZO-1蛋白，飲用

7、DSS 7天后模型組和CMS-H004組ZO-1蛋白表達(dá)均低于正常組，模型組和CMS-H004組表達(dá)量無顯著性差異。 3)正常組小鼠結(jié)腸幾乎不表達(dá)BD-2蛋白，模型組和CMS-H004組在飲用DSS第5天后即有BD-2表達(dá)，但CMS-H004組BD-2表達(dá)量比模型組少。 4)TNF-α刺激HT-29細(xì)胞后各組培養(yǎng)液上清中LDH含量無顯著性差異。 5)TNF-α體外刺激：HT-29細(xì)胞后，除正常組外均均有NF-K

8、B轉(zhuǎn)錄入核，其中CMS-H004組數(shù)目最多。 結(jié)論： 1)雙歧桿菌CMS-H004株能夠促進(jìn)炎癥因子IL-1β、IL-6、TNT-α提前釋放； 2)雙歧桿菌CMS-H004株能夠促進(jìn)腸上皮細(xì)胞NF-K B轉(zhuǎn)錄入核； 3)DSS和CMS-H004株能破壞腸上皮細(xì)胞緊密連接、誘導(dǎo)β-防御素-2表達(dá)，可能不是CMS-H004株加重?fù)p傷的主要機(jī)制。 第三章：CMS-H004菌株的分離、鑒定與相關(guān)研究。

9、 目的：為后續(xù)可能的開發(fā)、臨床研究及專利要求，進(jìn)一步對(duì)CMS-H004專利菌株進(jìn)行鑒定和相關(guān)研究，并將其保存于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)。 方法： 通過光鏡、電鏡觀察其形態(tài)學(xué)特征；通過生化反應(yīng)、X-gal顯色、代謝產(chǎn)物檢測觀察CMS-H004菌株生理、生化特征；通過(G+C)mol％測定、16SrRNA、質(zhì)粒檢測觀察其遺傳學(xué)特性；通過體外耐酸耐膽汁、抗生素敏感實(shí)驗(yàn)，研究其相關(guān)特性。 結(jié)果：

10、1)CMS-H004株是革蘭氏染色陽性桿菌，在MRS瓊脂平皿上呈現(xiàn)圓形，白色，隆起，不透明，邊緣整齊的濕潤菌落。 2)CMS-H004株能利用葡萄糖、甘露醇、乳糖、蔗糖、麥芽糖、水楊素、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、七葉靈、甘油、纖維二糖、海藻糖、松三糖、棉子糖、山梨醇、鼠李糖,API 20A編碼為：47757732。 3)CMS-H004株主要代謝產(chǎn)物是乙酸和乳酸，比值約為2.63：1，還可產(chǎn)生少量琥珀酸。 4)CM

11、S-H004株(G+C)mol％為58.64％，無質(zhì)粒。利用雙歧桿菌特異性引物能夠產(chǎn)生預(yù)期的擴(kuò)增條帶。 5)CMS-H004株體外能夠耐酸、耐膽汁。 6)氯霉素、氧哌嗪青霉素、四環(huán)素、頭孢孟多、先鋒噻唑、米諾環(huán)素、阿奇霉素、利福平對(duì)CMS-H004株抑菌圈均大于10mm，慶大霉素抑菌圈為7.5mm左右，其余33種抗生素?zé)o明顯抑菌圈。 結(jié)論： 1)CMS-H004株是青春雙歧桿菌的一株，已保存于中國典型培養(yǎng)

12、物保藏中心(CCTCC)，其典藏編號(hào)是：CCTCC M206119。 2)CMS-H004株能夠耐酸、耐膽汁，可以經(jīng)過上消化道定植于腸道。 3)CMS-H004株對(duì)氯霉素、氧哌嗪青霉素、四環(huán)素、頭孢孟多、先鋒噻唑、米諾環(huán)素、阿奇霉素、利福平敏感，對(duì)慶大霉素中度敏感，對(duì)其余33種抗生素耐藥。 第四章：雙歧桿菌CMS-H004株抗體的制備與檢測。 目的：制備雙歧桿菌CMS-H004株的兔多克隆抗體。

13、方法： 提取CMS-H004株菌體蛋白，加入佐劑作為抗原常規(guī)免疫新西蘭大白兔。達(dá)到一定效價(jià)后取血清，飽和硫酸銨沉淀法鹽析、透析脫鹽初步純化兔IgG。用ELISA、免疫印跡和免疫培養(yǎng)的方法檢測該抗體的最佳使用濃度、特異性、敏感性，并用此抗體檢測UC患者與正常人糞便中的CMS-H004菌株。 結(jié)果： 1)雙歧桿菌CMS-H004株能刺激產(chǎn)生兔多克隆抗體，隨著抗體濃度不斷降低，與CMS-H004菌體蛋白反應(yīng)也下降，在0

14、.05μg/ml以下反應(yīng)很弱且變化不大，選用0.5μg/ml為最佳使用濃度。 2)不同細(xì)菌與抗體(0.5μg/ml)反應(yīng)，抗體與雙歧桿菌CMS-H004菌體蛋白的反應(yīng)最強(qiáng)，有顯著性差異(P<0.05)；雙歧桿菌PFK、JSQ反應(yīng)次之，而乳酸桿菌CMS-H001、CMS-H002及NS幾乎無反應(yīng)。 3)部分正常人(4/20)和部分潰瘍性結(jié)腸炎患者(3/12)糞便中可見少量CMS-H004菌落生長，其余潰瘍性結(jié)腸炎(9/12