益生菌CMS-H002和CMS-H003菌株治療小鼠急性潰瘍性結腸炎的研究.pdf

1、第一章益生菌CMS-H002和CMS-H003菌株的特征分析。 目的：探討益生菌CMS-H002和CMS-H003菌株可能的藥用價值、遺傳穩(wěn)定性和抗生素敏感性。 方法： 1．益生菌CMS-H002和CMS-H003菌株的模擬胃腸環(huán)境的生存能力研究從湖南一泰公司種子庫中選擇菌株CMS—H002和CMS-H003，使用鹽酸，胃蛋白酶和牛膽汁模擬人類胃腸道環(huán)境，分別測定兩株益生菌對酸和膽汁的耐受能力。 2．益生

2、菌CMS-H002和CMS-H003菌株的遺傳穩(wěn)定性分析確定了菌株CMS—H002和CMS--H003具有較好的耐酸耐耐膽汁能力后，通過測定其G+C摩爾百分含量，評價這兩株細菌的遺傳穩(wěn)定性。 3．益生菌CMS-H002和CMS--H003菌株的抗生素敏感性分析采用瓊脂紙片擴散法分別測定菌株CMS—H002和CMS—H003對抗生素的敏感程度。 結果： 1．益生菌CMS—H002和CMS-H003菌株在PH值3．0

3、和膽汁濃度0．5％的環(huán)境中培養(yǎng)4小時，細菌數(shù)(以吸光度表示)無明顯減少；在PH值為2.5—3.5和膽汁濃度為0-5g／1的梯度培養(yǎng)基中培養(yǎng)4小時，細菌數(shù)也無明顯減少；在人工胃腸環(huán)境中培養(yǎng)4小時，細菌數(shù)與培養(yǎng)前也無差異，分別是1×10<'8>和1×10<'7>。 2.益生菌CMS-H002和CMS-H003菌株經(jīng)過模擬胃腸生境后，其G+C摩爾百分含量分別是46.6％和47.2％，與初級鑒定的結果一致。 3.益生菌CMS-H

4、002菌株在體外對羧芐青霉素、鏈霉素等33種抗生素敏感，對頭孢呋肟等9種抗生素不敏感。益生菌CMS-H003菌株在體外對氯霉素等18種抗生素敏感，對慶大霉素等24種抗生素不敏感。 結論： 菌株CMS-H002和CMS-H003對酸和膽汁有抗性，CMS-H002在體外對羧芐青霉素、鏈霉素等33種抗生素敏感，對頭孢呋肟等9種抗生素不敏感，G+C摩爾百分含量為46.6％。CMS-H003在體外對氯霉素等18種抗生素敏感，對慶大

5、霉素等24種抗生素不敏感，G+C摩爾百分含量分別為47.296。 第二章益生菌CMS-H002和CMS-H003菌株的藥效學研究。 目的：本部分實驗主要進行益生菌CMS-H002和CMS-H003治療UC的量效分析以及聯(lián)用益生菌治療UC的療效評價和部分作用機制探討。 方法： 1.UC模型的建立Balb/c小鼠自由飲用5％DSS(分子量5000)13天，建立改良右旋糖酐硫酸酯鈉(Dextran Sulfat

6、e Sodium，DSS)誘導的小鼠UC模型。 2.益生菌治療UC的量效分析將Balb/c小鼠隨機分為正常對照組、模型組、生理鹽水組、巴柳氮組、CMS-H002高劑量組、CMS-H002中劑量組、CMS-H002低劑量組、CMS-H003高劑量組、CMS-H003中劑量組和CMS-H003低劑量組。正常對照組小鼠每日自由飲用消毒蒸餾水，其余各組小鼠每日自由飲用5％DSS，連續(xù)13天。制模同一天，正常對照組和模型組無任何處理；生理

7、鹽水組每日給0.4ml.生理鹽水灌胃；巴柳氮組按照每日8mg/10g體重灌胃；CMS-H002高、中和低劑量組每日分別按照4.0×10<'9>cfu，4.0×10<'7>cfu，4.0×10<'5>cfu/10g體重灌胃一次， CMS-H003高、中和低劑量組每日分別按照4.0×10<'7>cfu，4.0×10<'5>cfu，4.0×10<'3>cfu/10g體重灌胃一次。每日觀察小鼠的體重、糞便性狀及隱血。13天后處死各組小鼠，測量結

8、腸長度，留取各組結腸標本，行HE染色并觀察光鏡下結腸組織學病理變化。 3.聯(lián)合用藥的治療觀察將小鼠隨機分為正常對照組、模型組、生理鹽水組、巴柳氮組、CMS-H002組、CMS-H003組及聯(lián)合用藥組。制模方法同上。制模同一天，正常對照組和模型組無任何處理；生理鹽水組每日給0.4ml生理鹽水灌胃；巴柳氮組每日按照8mg/10g體重灌胃； CMS-H002組每日按照4×10<'9>cfu/10g體重灌胃一次；CMS-H003組每日按

9、照4×10<'7>cfu/10g體重灌胃一次；聯(lián)合用藥組每日按照CMS-H0024×10<'9>cfu/10g體重和CMS-H003 4×10<'7>cfu/10g體重灌胃一次。每日觀察小鼠的體重、糞便性狀及隱血。于制模前一天和最后一天，分別留取每只小鼠糞便行菌群分析。13天后處死各組小鼠，測量結腸長度及重量，光鏡下觀察結腸組織學病理變化，電鏡下觀察結腸組織超微結構的改變，生化測定結腸組織中髓過氧化物酶含量的變化。 結果：

10、 1.益生菌治療UC的量效分析結果飲用5％DSS13天后小鼠結腸結腸長度由10.85縮短至8.65cm(P<0.05)，DAI由0增至8.4。用益生菌CMS-H002和CMS-H003分別干擾飲用DSS的小鼠后，結腸長度與干擾劑量成正比，DAI與干擾劑量成反比。益生菌CMS-H002和CMS-H003的量越大其結腸長度和DAI越接近正常。低劑量組小鼠結腸長度和DAI變化趨勢接近于巴柳氮干預組，比鹽水干預組好(P<0.05)。綜合分析實

11、驗結果，菌株CMS-H002和CMS-H003高劑量組對小鼠的一般情況、結腸病理變化的影響更優(yōu)于中劑量組。 2.聯(lián)合用藥的治療效果聯(lián)合用藥后，小鼠的一般情況、病理變化改善最為明顯。表現(xiàn)為兩菌合用組的結腸長度最長為9.98cm，結腸重量最輕為0.142g/g，DAI維持在最低水平為1.0-2.0，組織學評分最低為1.9，這也與光鏡下組織病理改變和電鏡下超微結構改變一致。 3.初步機制探討結果1)腸道菌群分析的結果顯示：UC

12、小鼠腸道菌群發(fā)生了紊亂，表現(xiàn)為乳酸桿菌數(shù)量明顯減少(P<0.01)，腸球菌和大腸桿菌數(shù)量不同程度增加(P<0.01)，擬桿菌、雙歧桿菌和金葡菌菌數(shù)無明顯變化。給與益生菌治療后，以兩菌合用組腸道菌群構成更接近正常菌群，表現(xiàn)為乳酸桿菌、丁酸梭菌和雙歧桿菌菌數(shù)明顯增加(P<0.01)，而大腸桿菌和腸球菌菌數(shù)明顯減少(P<0.01)，金葡菌和擬桿菌菌數(shù)無明顯變化。 結論： 1.改良的DSS誘導UC動物模型不僅繼承了原制模方法準確

13、可靠、方法簡單、成本低、重復性好，短期內(nèi)出現(xiàn)明顯癥狀及結腸炎典型病理變化的特點，還具有死亡率低，適用于中重度UC模型研究的優(yōu)點。 2.口服益生菌CMS-H002和CMS-H003菌株具有治療DSS誘導的Balb/c小鼠急性UC的作用，療效隨劑量的增加而增強。兩菌聯(lián)合治療作用優(yōu)于單菌，優(yōu)于巴柳氮?？寡缀驼{(diào)節(jié)腸道菌群可能是它們發(fā)揮治療UC作用的部分機制。 第三章聯(lián)用益生菌CMS-H002和CMS-H003菌株治療UC的機制。

14、 目的：本部分實驗主要進行聯(lián)用益生菌CMS-H002和CMS-H003菌株治療UC的機制研究。 方法： 將留取的各組結腸標本，分別應用免疫組化染色、酶聯(lián)免疫吸附法、免疫印記和半定量RT-PCR技術檢測小鼠結腸黏膜內(nèi)細胞因子EYAP-Ⅱ、TNF-a、IL-1B、IL-6、MCP-1、KC、P-selection、TF、PCNA和Caspase-1的表達。 結果： 1.飲用5％DSS13天的小鼠腸粘膜

15、中EMAP-Ⅱ、TNF-a、IL-1B、IL-6、MCP-1、KC、P-selection、TF和Caspase-1表達明顯上調(diào)(P<0.05)，PCNA明顯下調(diào)(P<0.05)。 2.給予益生茵和巴柳氮干預后可明顯阻止腸粘膜EMAP-Ⅱ、TNF-a、IL-1B、IL-6、MCP-1、KC、P-selection、TF和Caspase-1的表達，同時促進PCNA表達(P<0.05)。 3.兩菌合用組阻止EKAP-Ⅱ、TN

16、F-a、IL-1B、IL-6、P-selection、TF、PCNA和Caspase-1表達的作用優(yōu)于益生菌CMS-H002和CMS-H003菌株各單用組(P<0.05)。 結論： 1.益生菌CMS-H002和CMS-H003菌株可能是通過減輕炎癥，抑制血栓，抑制凋亡和促進增殖發(fā)揮其部分治療UC的作用。 2．EMAP Ⅱ參與了UC的發(fā)病過程，它可能是通過其自身促炎、趨化特性啟動炎癥，并上調(diào)其它促炎細胞因子、粘附因