外源性一氧化碳釋放分子(CORM)2對(duì)膿毒癥中凝血系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用及(部分)分子機(jī)制.pdf

1、膿毒癥(Sepsis)是指各種致病微生物或其毒素存在于血液或組織中,是機(jī)體對(duì)感染的一種全身性炎癥反應(yīng)(SIR),表現(xiàn)為不能控制的炎癥反應(yīng),是嚴(yán)重感染、重度創(chuàng)傷、大手術(shù)后,重型急性胰腺炎和休克等常見(jiàn)的并發(fā)癥。其繼續(xù)發(fā)展則可以導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)、膿毒癥和多器官功能障礙綜合征(MODS)。膿毒癥時(shí)由于炎性細(xì)胞因子的瀑布樣釋放,激活了凝血系統(tǒng),同時(shí)纖溶系統(tǒng)及生理性的抗凝系統(tǒng)受到不同程度的抑制,血液處于高凝狀態(tài),微血管內(nèi)微血栓廣泛

2、形成,導(dǎo)致微循環(huán)障礙,膿毒癥進(jìn)一步發(fā)展為嚴(yán)重膿毒癥及膿毒癥休克。膿毒癥時(shí)內(nèi)皮細(xì)胞活化表達(dá)組織因子(tissue factor,TF)增加進(jìn)而激活外源性凝血系統(tǒng)；另外血小板活化、聚集形成病理性血栓,這在炎癥和凝血之間復(fù)雜的相互作用中也占據(jù)著非常重要的中間位置[29、30]。
　　 一氧化碳(carbon monoxide,CO)在機(jī)體內(nèi)由血紅素加氧酶(HO)催化血紅素產(chǎn)生,CO過(guò)去曾被認(rèn)為是破壞細(xì)胞呼吸作用的有害物質(zhì)。近年來(lái)的研究

3、發(fā)現(xiàn)CO是一種氣體信號(hào)分子的,在離體和在體模型中對(duì)由內(nèi)毒素誘導(dǎo)產(chǎn)生的各種細(xì)胞因子具有顯著的抑制作用,我們前期研究也發(fā)現(xiàn)CO可以有效地緩解急性炎癥反應(yīng),表現(xiàn)出重要的細(xì)胞保護(hù)作用和抗炎效用,但其機(jī)制尚未完全明確。
　　 近來(lái),一種新合成的新型金屬-羰基化合物,一氧化碳釋放分子(tricarbonyldichlororuthenium(Ⅱ)dimer,CORM-2)被證實(shí)可以在機(jī)體內(nèi)緩慢釋放CO,擴(kuò)張主動(dòng)脈,降低心肌缺血再灌注損傷,具

4、有潛在的藥用價(jià)值。而目前,有關(guān)外源性CO對(duì)膿毒癥高凝狀態(tài)的影響的相關(guān)研究還比較少。為此,在本研究中,我們通過(guò)建立人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)模型及小鼠CLP膿毒癥模型,并用CORM-2干預(yù),進(jìn)行離體和在體實(shí)驗(yàn)研究,旨在探討外源性CO是否對(duì)膿毒癥早期高凝狀態(tài)具有抑制作用,并探討CO可能的作用機(jī)制。
　　 第一部分外源性一氧化碳釋放分子(CORM)2對(duì)LPS刺激HUVEC后組織因子(TF)表達(dá)的抑制作用及(部分)分子機(jī)制
　

5、　 目的:1、選用新生兒臍帶作為內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源建立HuVEC模型并驗(yàn)證；2、建立HUVEC膿毒癥模型并確定最佳LPS刺激濃度；3、確定CORM-2的最佳實(shí)驗(yàn)濃度；4、檢測(cè)CORM-2對(duì)LPS誘導(dǎo)HUVEC后TF及NF-κB活性的影響。
　　 方法： HUVEC來(lái)源于64小時(shí)內(nèi)新生胎兒臍帶,宜在37℃,含5％CO2、95％濕度的環(huán)境中培養(yǎng),采用M199培養(yǎng)基,定期換液,6-8天細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)融合后用胰蛋白酶消化,按1:3的比例傳代。觀

6、察HUVEC的形態(tài),檢驗(yàn)細(xì)胞內(nèi)ⅤⅢ因子相關(guān)抗原表達(dá)。再取傳代后生長(zhǎng)達(dá)到融合的HUVEC,棄去細(xì)胞培養(yǎng)基,加入1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml不同濃度LPS對(duì)HUVEC進(jìn)行刺激,培養(yǎng)箱培養(yǎng)4h,觀察炎癥反應(yīng)中多種細(xì)胞因子的變化,選定最適LPS濃度。運(yùn)用10μM、50μM、100μM、200μM不同濃度的CORM-2與HUVEC共孵育4h,培養(yǎng)箱條件均為37℃、5％CO2和95％相對(duì)濕度,觀察CORM-2的細(xì)胞毒性和確定實(shí)驗(yàn)濃

7、度。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)及凝膠電泳遷移率改變分析法(EMSA)檢測(cè)CORM-2應(yīng)用前后HUVEC膿毒癥模型TF活性、含量及NF-κB表達(dá)的情況。
　　 結(jié)果：本實(shí)驗(yàn)室成功建立了HUVEC模型,模型細(xì)胞生長(zhǎng)融合后呈典型的鋪路石狀排列,細(xì)胞內(nèi)ⅤⅢ因子相關(guān)抗原陽(yáng)性率達(dá)95％。HUVEC膿毒癥模型取10μg/ml LPS為最適濃度,建立過(guò)程規(guī)范,損傷后PMN粘附率明顯增高,NO、ROS活性明顯增加,iNOS、ICAM-1、HO

8、-1蛋白的表達(dá)明顯增加,NF-κB活性也顯著增高。10μM、50μM、100μM濃度對(duì)HUVEC進(jìn)行刺激效果較好,相比LPS組,CORM-2與LPS共同處理組對(duì)TF及NF-κB表達(dá)有明顯的抑制作用。
　　 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的HUVEC及相應(yīng)的膿毒癥模型符合實(shí)驗(yàn)要求,可以用于體外實(shí)驗(yàn)。HUVEC的膿毒癥模型可以用于在細(xì)胞水平研究炎癥的反應(yīng)機(jī)制,各種炎癥因子、黏附分子、轉(zhuǎn)錄因子等都發(fā)生了相應(yīng)的變化。本課題研究表明,外源性CO不但可

9、以抑制炎癥反應(yīng),對(duì)TF及NF-κB表達(dá)辦有明顯的抑制作用。這一結(jié)果表明,外源性CO可以通過(guò)干預(yù)外源性凝血途徑來(lái)抑制膿毒癥的發(fā)展,對(duì)于臨床危重病人的救治具有十分重要的意義。
　　 第二部分外源性一氧化碳釋放分子(CORM)2對(duì)CLP小鼠TF的抑制作用及(部分)分子機(jī)制
　　 目的:為了探討機(jī)體膿毒癥時(shí)的凝血系統(tǒng)的變化,我們建立了CLP小鼠的在體模型,并通過(guò)檢測(cè)小鼠膿毒癥后肝臟炎癥反應(yīng)程度,確保CLP模型建立的質(zhì)量,并進(jìn)一步

10、明確嚴(yán)重膿毒癥小鼠血液中TF與HUVEC膿毒癥模型中TF表達(dá)的關(guān)系,同時(shí)重點(diǎn)探討外源性CO對(duì)機(jī)體嚴(yán)重膿毒癥后外源性凝血途徑的抑制作用及部分分子機(jī)制。
　　 方法：6-8w大小的小鼠正常飼養(yǎng)1W后,2％異氟烷麻醉進(jìn)行盲腸結(jié)扎穿刺法建立小鼠膿毒癥模型,經(jīng)病理檢測(cè)和生命體征、細(xì)胞因子、黏附分子、轉(zhuǎn)錄因子及參與炎癥反應(yīng)放大與延續(xù)的多種酶等指標(biāo)確定模型的標(biāo)準(zhǔn)化。小鼠在CLP后立即靜脈注射CORM-2(8.0mg/kg)(加入在1521μl

11、生理鹽水中),以假手術(shù)組小鼠為對(duì)照組。用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)CORM-2應(yīng)用前后各時(shí)間段膿毒癥小鼠血漿中TF、TFPI含量表達(dá)的變化。
　　 結(jié)果：小鼠膿毒癥模型的建立過(guò)程規(guī)范,操作簡(jiǎn)單,且模型的檢測(cè)指標(biāo)明確。CLP術(shù)后24h小鼠肝細(xì)胞明顯腫脹,肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂；肝功能損害較重,血清中ALT含量升高；多種細(xì)胞因子及粘附分子表達(dá)明顯增加,AP-1、NF-κB蛋白表達(dá)明顯增加,膿毒癥模型達(dá)到了實(shí)驗(yàn)要求。外源性凝血系統(tǒng)啟動(dòng)

12、因子TF表達(dá)亦明顯增加而TFPI表達(dá)則減低。予CORM-2抑制炎癥反應(yīng)發(fā)展的同時(shí),可抑制TF、促進(jìn)TFPI的表達(dá)。
　　 結(jié)論：本CLP小鼠膿毒癥模型在機(jī)體損傷,肝臟損傷方面達(dá)到了預(yù)期的要求。本課題研究顯示,外源性CO的干預(yù)能明顯抑制外源性凝血系統(tǒng)啟動(dòng)因子TF表達(dá),同時(shí)促進(jìn)TF的拮抗因子TFPI的表達(dá)。因NF-κB可介導(dǎo)多種炎癥因子及TF的基因轉(zhuǎn)錄,而CORM-2可以抑制NF-κB蛋白表達(dá)這在第一部分的離體研究中已闡述,這一結(jié)果

13、提示外源性CO至少部分是通過(guò)抑制NF-κB的活性來(lái)干預(yù)外源性凝血系統(tǒng)的啟動(dòng)。
　　 目的:1、檢測(cè)高濃度氧與CORM-2聯(lián)合干預(yù)下CLP小鼠凝血因子的變化；2、探討高氧與CORM-2聯(lián)合干預(yù)下CLP小鼠血小板膜糖蛋白及血小板功能指標(biāo)的變化。
　　 方法：先使小鼠處于純氧環(huán)境中0.5小時(shí)作為預(yù)處理,再行CLP處理及CORM-2干預(yù)。對(duì)不同時(shí)間段處理組小鼠先以雙波長(zhǎng)吸光度比值法檢測(cè)血液中碳氧血紅蛋白濃度(HBCO％),并計(jì)算

14、其存活率；再取全血檢測(cè)凝血因子FIB、D-D水平；分離富血小板血漿(PRP),用流式細(xì)胞儀分析PRP中血小板膜糖蛋白CD41、CD61、CD62-p水平,以檢測(cè)膿毒癥時(shí)血小板活化程度；最后取抗凝血,用玻球法分析血小板粘附率,用血小板聚集儀分析血小板聚集功能的變化,并制出聚集率曲線圖,從功能上分析高氧聯(lián)合CORM-2對(duì)CLP小鼠血小板的作用。
　　 結(jié)果：高氧聯(lián)合CORM-2干預(yù) CLP膿毒癥小鼠后可以明顯降低血液中HBCO的含量

15、,并有效提高CLP小鼠的存活率；聯(lián)合干預(yù)亦可降低凝血因子FIB、D-D的表達(dá):同時(shí)降低血漿中血小板膜糖蛋白CD61、CD62p(CD41變化不太明顯),對(duì)活化后血小板粘附和聚集功能的亢進(jìn)也有明顯的抑制作用。
　　 結(jié)論：本研究采用高氧聯(lián)合CORM-2對(duì)CLP小鼠進(jìn)行干預(yù),比單用CORM-2能更好地發(fā)揮外源性CO的作用。同時(shí),從凝血因子、血小板活化及其功能指標(biāo)的檢測(cè)上也顯示了高氧聯(lián)合CORM-2可以在一定程度上抑制膿毒癥時(shí)凝血系統(tǒng)