貢嘎蝙蝠蛾粉擬青霉(Paecilomyces farinosus)遺傳多樣性的SCoT和ISSR標(biāo)記研究.pdf

1、貢嘎蝙蝠蛾（Hepialus gonggaensis）是形成冬蟲夏草的蟲體之一，在其繁育過程中易被粉擬青霉（Paecilomyces farinosus）侵染而罹患擬青霉病。為研究病原菌的遺傳多樣性，分別采用L12(41×33)混合水平正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化SCoT-PCR和ISSR-PCR的反應(yīng)體系并篩選出最佳反應(yīng)循環(huán)次數(shù)、引物及相應(yīng)退火溫度，在此基礎(chǔ)上利用SCoT和ISSR兩種分子標(biāo)記方法研究了80株粉擬青霉的基因組DNA并進(jìn)行聚類分析和

2、兩種標(biāo)記方法的比較。試驗(yàn)結(jié)果如下：
　　1.粉擬青霉菌遺傳多樣性的SCoT分析
　　優(yōu)化后的粉擬青霉SCoT-PCR反應(yīng)體系為:20μL體系中，DNA45ng、引物0.7μmol/L、MIX混合液7μL、Taq酶1U，反應(yīng)體系的最適循環(huán)次數(shù)為40次。應(yīng)用此反應(yīng)體系從15個(gè)SCoT通用引物中選出條帶多態(tài)性高且清晰的10條引物，分別是S12、S13、S14、S15、S19、S28、S29、S31、S32、S34。分別以80株粉擬

3、青霉DNA為模板，采用上述PCR反應(yīng)條件進(jìn)行SCoT-PCR。10條SCoT引物共獲得104個(gè)擴(kuò)增位點(diǎn)，其中多態(tài)性位點(diǎn)69個(gè)，多態(tài)性比率為66.35％。對SCoT-PCR的結(jié)果進(jìn)行聚類分析得出:80株粉擬青霉菌種內(nèi)有著豐富的遺傳多態(tài)性，遺傳相似系數(shù)在0.66-0.95之間，且在0.751處可分為六大類。
　　2.粉擬青霉菌遺傳多樣性的ISSR分析
　　優(yōu)化后的ISSR-PCR反應(yīng)體系為:20μL體系中，DNA60ng、引物0

4、.6μmol/L、MIX混合液6曲、Taq酶0.8U，反應(yīng)體系的最適循環(huán)次數(shù)為40次。應(yīng)用此反應(yīng)體系從15個(gè)ISSR通用引物中選出條帶清晰且多態(tài)性高的10條引物，分別是701、702、703、807、808、809、810、835、855、873。分別以80株粉擬青霉DNA為模板，采用上述PCR反應(yīng)條件進(jìn)行ISSR-PCR。10條ISSR引物共獲得96個(gè)擴(kuò)增位點(diǎn)，其中多態(tài)性位點(diǎn)56個(gè)，多態(tài)性百分率為58.33％。對ISSR-PCR結(jié)果進(jìn)

5、行聚類分析得出:80株菌的遺傳相似系數(shù)在0.70-0.96之間，在0.756處可分為五大類。
　　3.粉擬青霉遺傳多樣性的SCoT和ISSR比較分析
　　SCoT擴(kuò)增的平均條帶數(shù)、多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)和多態(tài)性百分率均略高于ISSR標(biāo)記，說明SCoT標(biāo)記能檢測出更多的多態(tài)性遺傳位點(diǎn)，略優(yōu)于ISSR分子標(biāo)記。ISSR標(biāo)記的遺傳相似系數(shù)的范圍及其平均值，以及將供試菌株分類處的遺傳相似系數(shù)均大于SCoT標(biāo)記，說明SCoT標(biāo)記方法比ISSR標(biāo)

6、記方法具有更高的辨識(shí)度。
　　根據(jù)SCoT和ISSR兩種標(biāo)記方法得出來的兩個(gè)聚類結(jié)果可以得出以下結(jié)論:分離自樓房外南面木頭的65號(hào)菌單獨(dú)分成一大類是因其遺傳距離最遠(yuǎn);同一地方地理來源的菌株沒有全部分到同一類群中，正如分離自樓房南面外墻的12號(hào)和26號(hào)菌以及分離自樓房北面外墻的20和61號(hào)菌分別被分到不同的兩大類群中;分離自二樓實(shí)驗(yàn)室8、9、10、11、14號(hào)房以及中央大廳的菌株都被分在不同類群中。來源于同一蟲體或蟲態(tài)的菌株大部分是

7、分在不同類群中，但也有少數(shù)菌株分在同一類。例如分離自貢嘎蛹上的16號(hào)和46號(hào)菌分別被分到不同的兩大類群中，以及分離自3-4齡貢嘎幼蟲身上的37和62號(hào)菌分別被分到不同的兩大類群中。分離自5-6齡貢嘎幼蟲身上的48號(hào)和78號(hào)菌都?xì)w屬于同一類群;分離自西藏林芝幼蟲身上的1號(hào)菌、6-8齡貢嘎幼蟲身上的14號(hào)菌和貢嘎蛹上的16號(hào)菌都分在了第Ⅰ(1)亞類中。
　　試驗(yàn)結(jié)果中分離自人工繁育基地不同環(huán)境或蟲態(tài)的蝙蝠蛾粉擬青霉與采集分離自地理遠(yuǎn)緣