貢嘎蝙蝠蛾粉擬青霉的遺傳多樣性及生物學(xué)特性研究.pdf

1、由粉擬青霉菌(Paecilomyces farinosus)引起的貢嘎蝙蝠蛾（Hepialus gonggaensis）擬青霉病是貢嘎蝙蝠蛾人工繁育過程中面臨的主要病害之一。為明確貢嘎蝙蝠蛾擬青霉病的傳播途徑及病原變異，本文利用ISSR分子標(biāo)記方法對82株采自不同蟲態(tài)發(fā)育時(shí)期及其相應(yīng)生長環(huán)境介質(zhì)中的粉擬青霉菌株進(jìn)行了遺傳多樣性研究和生物學(xué)特性差異研究，以期為有效控制蝙蝠蛾擬青霉病提供預(yù)測和防治依據(jù)。研究結(jié)果如下:
　　1.粉擬青霉

2、菌遺傳多樣性分析
　　構(gòu)建粉擬青霉菌ISSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系并進(jìn)行粉擬青霉菌遺傳多樣性分析。以粉擬青霉菌的基因組DNA為模板，采用正交設(shè)計(jì)方法(L16(43))對ISSR-PCR反應(yīng)體系中的引物、Taq酶、模板、PCR反應(yīng)MIX混合液等4個(gè)重要參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，初步建立了適合粉擬青霉菌的ISSR-PCR反應(yīng)體系，即25μL PCR反應(yīng)體系中，模板DNA70 ng、引物0.5μmol/L、PCR反應(yīng)MIX混合液8μL、Taq酶1U

3、。應(yīng)用該優(yōu)化體系從20個(gè)ISSR通用引物（由加拿大哥倫比亞大學(xué)公布）中篩選出10條帶譜清晰、多態(tài)性高、穩(wěn)定性好的引物，并對所有菌株基因組DNA進(jìn)行ISSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)，10個(gè)引物共獲得72個(gè)擴(kuò)增位點(diǎn)，擴(kuò)增片段大小在150-2000 bp之間;其中多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)為46個(gè)，多態(tài)性百分率達(dá)63.9％。對擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行聚類分析，結(jié)果表明:供試的82株菌株之間存在豐富的遺傳多態(tài)性，其遺傳距離在0.561-0.912之間;在閾值為0.606處可以較

4、明顯地分為五組。
　　通過對從折多山冬蟲夏草人工繁育基地的貢嘎蝙蝠蛾人工繁育基質(zhì)、工具、室內(nèi)空氣、外界環(huán)境和廢棄物中分離的粉擬青霉菌與從罹病蟲體中分離的粉擬青霉菌進(jìn)行ISSR分析發(fā)現(xiàn)，供試的82株粉擬青霉菌在ISSR聚類分析上表現(xiàn)不同的聚類關(guān)系，這說明多年長期集約化人工繁育貢嘎蝙蝠蛾，使得康定折多山冬蟲夏草人工繁育基地的粉擬青霉菌存在豐富的遺傳多樣性，并與西藏林芝、甘肅瑪曲、青海拉脊雪山、四川小金等冬蟲夏草天然產(chǎn)地進(jìn)行了充分的病原

5、菌交流，培養(yǎng)基地的所有環(huán)境及介質(zhì)都可成為貢嘎蝙蝠蛾發(fā)生擬青霉病的病原來源。試驗(yàn)中采自病蟲體的粉擬青霉菌均與采自試驗(yàn)房（8號、9號、10號）、部分中央大廳和樓房南面外墻的菌株具有較高的同源性，這可以推斷引起蟲體發(fā)病的病源具有多元性;中央大廳和試驗(yàn)房（8號、9號、10號）可能是引起蟲體發(fā)病的主病源，而樓房南面外墻是次病源;進(jìn)一步說明了折多山冬蟲夏草人工繁育基地半人工繁育貢嘎蝙蝠蛾發(fā)生擬青霉病的病菌來源的廣泛性。
　　2.粉擬青霉菌生物

6、學(xué)特性差異研究
　　根據(jù)遺傳差異程度的不同，試驗(yàn)選用菌株2-J4-1、1-WQN-1、2-E2-2、2-M3-1、L-8、1-E10-1、2-G5、1-C6-2（編號依次為:13、20、22、33、54、58、68、82）做生物學(xué)特性差異研究，采用鄧肯氏新復(fù)極差分析法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析與處理。試驗(yàn)結(jié)果如下:各粉擬青霉菌株對溫度的適應(yīng)范圍較廣，在5℃-30℃溫度范圍內(nèi)都可以正常生長，10℃-25℃條件下可以正常產(chǎn)孢;生長最適溫度為20℃-

7、25℃，產(chǎn)孢最適溫度為20℃;試驗(yàn)所有菌株在pH4-pH12均可以生長，大部分菌株在pH值為7時(shí)生長最快，產(chǎn)孢最多，極顯著差異于其他pH處理;黑暗條件下各粉擬青霉菌菌落生長最快，隨著光照的增加生長減慢;碳源有利于各粉擬青霉菌株的生長，在含有葡萄糖、乳糖和淀粉的培養(yǎng)基中生長的粉擬青霉菌均比對照培養(yǎng)基中的粉擬青霉菌生長快，其中，大部分菌株在以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基中生長最好，與其他碳源處理差異極顯著，在以淀粉為碳源的培養(yǎng)基中，各粉擬青霉菌菌絲

8、生長最差，但產(chǎn)孢最豐富;氮源有利于粉擬青霉菌產(chǎn)孢，各粉擬青霉菌對氮源中的甘氨酸、硝酸鉀和硫酸銨能夠很好地利用，在含有甘氨酸、硝酸鉀和硫酸銨的培養(yǎng)基中生長的粉擬青霉菌比對照培養(yǎng)基中生長的粉擬青霉菌的菌落厚且產(chǎn)孢多，其中，在以甘氨酸為氮源的培養(yǎng)基中生長的粉擬青霉菌生長最好，產(chǎn)孢最多。
　　最適生長條件下，各粉擬青霉菌株之間在生長和產(chǎn)孢方面存在一定差異。其中，菌株2-G5在生長和產(chǎn)孢的最適光照條件、氮源以及生長最適碳源等方面與其他菌株之