TWEAK-p38 MAPK信號通路在人工關(guān)節(jié)假體周圍骨溶解中的作用研究.pdf

1、背景:
　　假體周圍炎性骨溶解是人工關(guān)節(jié)置換術(shù)后的嚴(yán)重并發(fā)癥。腫瘤壞死因子樣弱凋亡誘導(dǎo)因子(tumor necrosis factor like weakinducer of apoptosis，TWEAK)是1997年新發(fā)現(xiàn)的腫瘤壞死因子配體超家族中的一員。TWEAK在人體多種組織中均有表達(dá)，是一種廣泛表達(dá)的腫瘤壞死因子家族的配體。多種免疫細(xì)胞（單核-巨噬細(xì)胞，樹狀突細(xì)胞，活化的T細(xì)胞等）均可產(chǎn)生其可溶性的細(xì)胞因子形式。在急慢性

2、炎癥或損傷的情況下，TWEAK表達(dá)顯著增加。已經(jīng)越來越多研究發(fā)現(xiàn)，TWEAK通過與其受體相結(jié)合，發(fā)揮各種各樣的生物學(xué)效應(yīng)，包括釋放促炎性因子、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、刺激細(xì)胞凋亡以及調(diào)節(jié)組織修復(fù)與再生。TWEAK能促激活經(jīng)典的核轉(zhuǎn)錄因子κ B(Nuclear Factorκ B NF-κB)通路，除此之外，研究發(fā)現(xiàn)，TWEAK還可激活非經(jīng)典的NF-κB通路以及絲氨酸/蘇氨酸絲裂原激活蛋白(mitogen-ativated protein kina

3、se，MAPK)激酶通路。
　　MAPKs信號通路具有生物進(jìn)化的高度保守性，廣泛存在于細(xì)胞內(nèi)，其主要功能是將細(xì)胞外刺激信號傳遞到細(xì)胞內(nèi)，并引起細(xì)胞的一系列生物學(xué)反應(yīng)。目前已發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)有多條MAPK通路:細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal regulatedkinase，ERK1/ERK2)通路、c-jun氨基末端激酶(c-jun N-terminal kinase，JNK)通路(又稱為應(yīng)激活化蛋白激酶st

4、ress-activated protein kinase，SAPK)、p38MAPK(p38α，p38β，p38Y and p38δ)通路和ERK3/ERK4/ERK5通路。其中p38MAPK是MAPK家族的重要成員，當(dāng)他們受到環(huán)境應(yīng)激或細(xì)胞因子刺激時，能使效應(yīng)細(xì)胞產(chǎn)生增殖、分化、遷移、浸潤和炎癥等生命活動。p38 MAPK的抑制劑SB203580，為吡啶咪唑類衍生物，能特異性地作用于p38 ATP結(jié)合活性位點(diǎn)Thr106，使p38失

5、去了與ATP結(jié)合的能力，從而使其失去激酶活性。
　　白介素-6(Interleukin6，IL-6)是一種多功能的細(xì)胞因子，主要由單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等分泌，發(fā)揮一系列的免疫效應(yīng)。單核細(xì)胞趨化蛋白-1(Monocyte chemiattractant protein1，MCP-1)屬于趨化因子超家族的一員，其主要功能是通過趨化作用，使單核細(xì)胞離開血流而分化成為分布于組織中的巨噬細(xì)胞，參與著機(jī)體的免疫和炎癥反應(yīng)。研究表明這

6、些因子都參與著關(guān)節(jié)置換術(shù)后假體周圍無菌性松動的病理過程
　　隨著對炎性骨溶解研究的深入，特別是在溶骨性因子，受體/配體家族成員及其細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路對破骨前體細(xì)胞分化、成熟及破骨細(xì)胞活化、功能影響方面研究的進(jìn)展，針對骨溶解機(jī)制中某一環(huán)節(jié)進(jìn)行干預(yù)成為可能。目前已有少量文獻(xiàn)報道，p38MAPK信號通道參與了磨損微粒誘導(dǎo)的骨溶解這一病理過程，Zwerina等人通過風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的小鼠模型研究，不僅發(fā)現(xiàn)p38MAPK對于炎性骨破壞起著重要作

7、用，同時還發(fā)現(xiàn)抑制p38MAPK是減輕炎性骨破壞的重要手段。此外，在臨床上對狼瘡腎炎、肌炎等疾病的研究中發(fā)現(xiàn)，p38 MAPK信號通道能被TWEAK激活，并發(fā)揮致病作用。但是p38 MAPK信號通道在人工關(guān)節(jié)置換術(shù)后假體松動的界膜組織中如何表達(dá)，尚存在爭議。而TWEAK作為TNF配體超家族的成員是否也參與假體周圍無菌性松動的發(fā)生和發(fā)展，尚未見文章報道。
　　基于以上的理論支撐，本研究擬通過組織形態(tài)學(xué)觀察及分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，探討人

8、工關(guān)節(jié)假體周圍骨溶解的相關(guān)問題。
　　1.在松動假體周圍界膜組織中，TWEAK和p38MAPK表達(dá)情況，探討其表達(dá)與假體松動的相關(guān)性。
　　2.用鈦微粒刺激體外培養(yǎng)巨噬細(xì)胞(RAW246.7)，通過p38 MAPK抑制劑進(jìn)行干預(yù)，觀察TWEAK及p38 MAPK的表達(dá)，探討TWEAK-p38MAPK信號通過在其中可能的作用機(jī)制。
　　3.制備小鼠顱骨骨溶解的動物模型，用p38MAPK抑制劑進(jìn)行干預(yù)，觀察TWEAK及p3

9、8MAPK的表達(dá)，探討TWEAK-p38MAPK-IL-6/MCP-1信號通道在炎性骨溶解中的作用，以及p38 MAPK抑制劑對人工關(guān)節(jié)無菌性松動靶向治療的可能性。
　　一.TWEAK及p38MAPK在關(guān)節(jié)松動假體周圍界膜組織中的表達(dá)及臨床意義
　　方法:
　　研究不同來源的滑膜組織及松動假體周圍界膜組織（正?；ぁ⒐顷P(guān)節(jié)炎滑膜、界膜），通過HE染色和免疫組織化學(xué)染色，對組織標(biāo)本進(jìn)行定性觀察。通過RT-PCR和West

10、ern Blot等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法檢測組織中TWEAK及p38MAPK的表達(dá)，對組織標(biāo)本進(jìn)行定量觀察。
　　結(jié)果:
　　HE染色結(jié)果顯示，與正?；そM比較，骨關(guān)節(jié)炎滑膜組基質(zhì)和纖維細(xì)胞較多，少許炎性細(xì)胞浸潤，鏡下見滑膜細(xì)胞，但其增生不明顯。而在界膜組中滑膜細(xì)胞增生明顯伴有局灶性炎性細(xì)胞浸潤，顯微鏡下可見有大量的單核細(xì)胞，在細(xì)顆粒狀物周圍尤為明顯。TWEAK的免疫組化染色結(jié)果顯示，界膜組中可見大量胞質(zhì)呈棕黃色的單核細(xì)胞（陽性

11、細(xì)胞）;骨關(guān)節(jié)炎滑膜組中可見散在的胞質(zhì)呈棕黃色的單核細(xì)胞;正?；そM中陽性細(xì)胞更少。p-p38MAPK的免疫組化染色結(jié)果與TWEAK鏡下觀察結(jié)果類似。
　　在界膜組的TWEAK mRNA以及蛋白的表達(dá)要明顯高于正?；そM及骨關(guān)節(jié)炎滑膜組，并且骨關(guān)節(jié)炎滑膜組的TWEAK mRNA以及蛋白表達(dá)水平亦高于正常的滑膜組。p-p38MAPK蛋白表達(dá)情況與TWEAK表達(dá)類似，在界膜組中最高，關(guān)節(jié)炎組次之，正?；そM最少，兩兩比較均由統(tǒng)計學(xué)差異

12、。TWEAK和p-p38MAPK表達(dá)呈正相關(guān)。
　　結(jié)論:
　　TWEAK可能是炎性骨溶解的啟動因素之一，p38MAPK可能是參與調(diào)控磨損微粒誘導(dǎo)骨溶解的中心環(huán)節(jié)，進(jìn)一步探索TWEAK及p38MAPK在假體周圍炎性骨溶解中的作用機(jī)制，對臨床防治人工關(guān)節(jié)無菌性松動具有重要意義。
　　二.p38MAPK抑制劑對鈦微粒刺激巨噬細(xì)胞分泌炎性因子的影響
　　方法:
　　體外培養(yǎng)巨噬細(xì)胞(RAW246.7)，分組:A組

13、:對照組（細(xì)胞單純培養(yǎng)組），B組:A+SB203580（特異性p38MAPK阻斷齊），C組:A+TiPs，D組:A+TiPs+SB203580。將上述各組分別加入24孔培養(yǎng)板，在5％CO2，37℃，95％濕度條件下孵育48小時候收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)上清。采用Western Blot分別檢測TWEAK及p-p38MAPK的蛋白表達(dá)水平。采用ELISA法分別檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-6，MCP-1表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　TWEA

14、K蛋白的表達(dá):C組較A組、B組和D組明顯增加(P＜0.05)。且D組較A組B組明顯增加(P＜0.05)。p-p38MAPK蛋白表達(dá):C組明顯高于A組，B組及D組(P＜0.05)。A組明星高于B組、D組(P＜0.05)，B組，D組兩組間沒有明顯差異。細(xì)胞培養(yǎng)上清中，IL-6和MCP-1的表達(dá):C組較A組、B組和D組明顯增加(P＜0.05)，A組，B組兩組間沒有明顯差異。
　　結(jié)論:
　　鈦微粒能刺激巨噬細(xì)胞通過激活p38MAP

15、K信號通路分泌炎性因子，而SB203580能通過抑制p38MAPK，減輕巨噬細(xì)胞的炎性因子分泌，因此推測TWEAK-p38MAPK-IL-6/MCP-1信號通道在微粒誘導(dǎo)的炎性骨溶解中發(fā)揮著重要作用。進(jìn)一步探索p38 MAPK信號通路，對臨床防治人工關(guān)節(jié)無菌性松動具有重要意義。
　　三.p38MAPK抑制劑對鈦微粒誘導(dǎo)炎性骨溶解的實(shí)驗(yàn)研究
　　方法:
　　雄性C57BL/J6小鼠體重18-22g，12-14周齡。隨機(jī)分

16、成:假手術(shù)組（A組）、SB203580組（B組）、TiPs植入組（C組）和TiPs植入+SB203580組（D組），SB203580以0.1mg/kg/d腹膜內(nèi)注射。術(shù)后兩周取材，采用TRAP染色觀察骨溶解動物模型里的破骨細(xì)胞形態(tài)及數(shù)量，ELISA法檢測動物模型的炎性細(xì)胞因子。
　　結(jié)果:
　　TRAP染色結(jié)果顯示，在C組（TiPs的顱骨模型）可見大量破骨細(xì)胞形成，呈紫紅色，散在或者連續(xù)存在。而沒加TiPs的A組和B組中，均

17、沒見到破骨細(xì)胞及骨破壞。在D組（TiPs+SB203580的顱骨模型）中，僅在顱骨溶解邊緣有少量紫紅色細(xì)胞，陽性細(xì)胞較C組明顯減少。顱骨骨破壞也較C組明顯減輕。
　　ELISA結(jié)果顯示，C組在鈦微粒的刺激誘導(dǎo)下，TWEAK、p-p38MAPK、IL-6和MCP-1的含量要明顯高于其他三組(P＜0.05)。而D組由于有SB203580的干預(yù)，不僅p-p38MAPK得到了明顯的抑制，TWEAK，IL-6，MCP-1表達(dá)也明顯減少。與C

18、組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。其余三組之間差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論:
　　SB203580能通過抑制p38MAPK信號通路，降低炎性因子的表達(dá)，抑制破骨細(xì)胞的生成，減輕鈦微粒誘導(dǎo)的炎性骨溶解。因此，我們認(rèn)為，TWEAK-p38MAPK-IL-6/MCP-1信號通道在微粒誘導(dǎo)的炎性骨溶解中發(fā)揮著重要作用。抑制p38 MAPK信號通路可能成為抑制炎性骨溶解的新途徑，進(jìn)一步研究p38MAPK信號通路對臨床防治人工關(guān)節(jié)無菌性松動具