復(fù)方芪參提取物調(diào)控TGF-β-Smad信號(hào)及miR-145、miR-21表達(dá)發(fā)揮抗肝纖維化-肝細(xì)胞癌作用.pdf

1、背景：
　　肝細(xì)胞肝癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）死亡率高，是威脅人類健康的重大疾病之一。多數(shù)HCC均由慢性肝臟炎癥和肝纖維化發(fā)展而來，深入研究HCC的發(fā)病機(jī)制，尋求特異的藥物作用靶點(diǎn)，開發(fā)新的藥物，阻斷慢性肝炎-肝纖維化-HCC的發(fā)展過程是防治HCC的重要途徑。
　　TGF-β信號(hào)通路是迄今研究最為深入、與肝臟慢性炎癥-纖維化-HCC轉(zhuǎn)化關(guān)系最為緊密的信號(hào)通路之一，在抗肝纖維化-HCC藥物的

2、機(jī)制研究中受到特別關(guān)注。TGF-β1通過Ⅰ型TGF-β受體（TGF-βtypeⅠreceptor，TβRⅠ）磷酸化Smad2、Smad3的C末端(C-terminal region，C)，另一方面活化促分裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activatedprotein kinase，MAPK)通路，包括細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（Extracellular signal-regulated kinase，ERK）通路、c-Jun氨基端激酶（c

3、-Jun N-terminal kinase，JNK）通路和p38通路，磷酸化Smad2、Smad3的連接區(qū)（Linker region，L），形成多種Smad2/3磷酸化亞型。其中pSmad3C傳遞生長(zhǎng)抑制信號(hào)，pSmad2L/C傳遞促纖維化信號(hào)，pSmad3L傳遞促癌信號(hào)。上述 Smad信號(hào)的傳遞均需與Smad4共同構(gòu)成Smad2/3/4復(fù)合物，并借助于核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)受體importin家族中的 Imp7和Imp8，轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)調(diào)控靶

4、基因如纖維蛋白溶酶原激活物抑制劑（Plasminogen activator inhibitor，PAI-1)的轉(zhuǎn)錄。而Smad7則對(duì)TGF-β/Smad信號(hào)通路產(chǎn)生反饋抑制作用。此外，TGF-β/Smad信號(hào)通路還通過與microRNA之間的相互作用調(diào)控HCC發(fā)生發(fā)展，以具有抑癌作用的miR-145和促癌作用的miR-21尤為重要。
　　復(fù)方芪參提取物(Compound Astragalus and Salvia miltior

5、rhiza extract，CASE)是對(duì)黃芪與丹參的有效成分黃芪總苷、黃芪多糖、丹酚酸進(jìn)行配伍組方而成。本課題組前期研究顯示CASE在體內(nèi)、外均能發(fā)揮抗肝纖維化-HCC效應(yīng)，并通過體外研究證實(shí)了 CASE對(duì) TGF-β/Smad信號(hào)通路的調(diào)控作用；在二乙基亞硝胺(Diethylinitrosamine，DEN)誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化-HCC模型中發(fā)現(xiàn)CASE可阻止肝纖維化-HCC發(fā)展過程中pSmad3C的生長(zhǎng)抑制信號(hào)向pSmad2L/C的

6、促纖維化信號(hào)和pSmad3L的促癌信號(hào)轉(zhuǎn)化。但CASE對(duì)Smad4、Smad7、PAI-1以及負(fù)責(zé)Smad轉(zhuǎn)運(yùn)入核的 Imp7/8表達(dá)的影響仍缺乏體內(nèi)研究證據(jù)，而 CASE是否對(duì)與TGF-β/Smad信號(hào)通路關(guān)聯(lián)密切的miR-145和miR-21表達(dá)產(chǎn)生調(diào)控作用也尚不明確。為此，我們擬通過體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步明確CASE的抗肝纖維化-HCC機(jī)制。
　　目的：
　　1.在DEN誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化-HCC動(dòng)態(tài)模型中，明確CASE

7、對(duì)Smad4、Smad7及下游PAI-1和Imp7、Imp8表達(dá)的影響；
　　2.在DEN誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化-HCC動(dòng)態(tài)模型和HepG2細(xì)胞中，明確CASE對(duì)miR-21、miR-145表達(dá)的影響。
　　方法：
　　1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組、模型構(gòu)建及處理
　　180只清潔級(jí)健康雄性SD大鼠，隨機(jī)分為正常對(duì)照組，DEN模型組，CASE低、中、高劑量（60、120、240mg/kg）治療組，陽性藥物對(duì)照組（即護(hù)肝片組，92

8、1mg/kg），每組30只。DEN模型組、CASE低、中、高三個(gè)劑量治療組以及陽性藥物對(duì)照組的大鼠給予0.2％DEN溶液灌胃至14周，構(gòu)建肝纖維化-HCC動(dòng)態(tài)模型；正常對(duì)照組給予等量溶媒灌胃。從造模之日開始至第16周實(shí)驗(yàn)結(jié)束，CASE三個(gè)劑量治療組大鼠分別給予不同劑量的 CASE溶液灌胃，陽性藥物對(duì)照組給予護(hù)肝片溶液灌胃；正常對(duì)照組和DEN模型組給予相應(yīng)溶媒灌胃。在實(shí)驗(yàn)第12周和第16周結(jié)束時(shí)，分2批處死大鼠。
　　2.細(xì)胞培養(yǎng)分

9、組及處理
　　HepG2細(xì)胞體外培養(yǎng)，更換無血清的 DMEM同步化細(xì)胞。同步化后分別加入TGF-β1（終濃度為9pmmol﹒L-1）活化細(xì)胞，時(shí)間分別為3h、6h、12h和24h，以未活化的細(xì)胞為對(duì)照，提取總RNA待測(cè)；
　　HepG2細(xì)胞體外培養(yǎng)，分為對(duì)照組、模型組和CASE20、40、80mg﹒L-1濃度處理組。更換無血清的DMEM同步化細(xì)胞，CASE20、40、80mg﹒L-1濃度處理組分別加入相應(yīng)濃度的藥物，繼續(xù)培養(yǎng)

10、24h。為檢測(cè)CASE對(duì)miR-145和miR-21的影響，分別在培養(yǎng)結(jié)束前3h或藥物處理的同時(shí)加入 TGF-β1活化細(xì)胞，對(duì)照組加入相應(yīng)溶媒。提取總RNA待測(cè)。
　　3.免疫組化法檢測(cè)肝臟組織中Smad4、PAI-1蛋白
　　制作組織芯片，分別用鼠抗Smad4多克隆抗體、兔抗PAI-1多克隆抗體孵育切片，加入二抗后，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，在光學(xué)倒置顯微鏡下拍攝照片，胞漿出現(xiàn)棕黃色認(rèn)定為陽性反應(yīng)，采用Image J軟件測(cè)定

11、平均光密度值（Mean density），計(jì)算其平均值，反映蛋白表達(dá)的水平，進(jìn)行定量比較。
　　4. Western blot法檢測(cè)肝臟組織中Smad4、Smad7、PAI-1、Imp7、Imp8
　　從液氮凍存的肝臟組織中提取總蛋白，分別采用鼠抗Smad4多克隆抗體、羊抗Smad7多克隆抗體、兔抗PAI-1多克隆抗體、兔抗Imp7多克隆抗體、兔抗Imp8多克隆抗體，檢測(cè) Smad4、Smad7、PAI-1、Imp7和Imp

12、8蛋白表達(dá)，以GAPDH為參照。
　　5.qRT-PCR檢測(cè)miR-145和miR-21
　　從液氮凍存的肝臟組織和HepG2細(xì)胞中提取總 RNA，反轉(zhuǎn)錄后，分別采用miR-145、miR-21、內(nèi)參U6的鼠源或人源引物，SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)檢測(cè)miR-145和miR-21相對(duì)表達(dá)量，根據(jù)融解曲線確定擴(kuò)增反應(yīng)特異性。
　　結(jié)果：
　　1. CASE對(duì)DEN誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化-HCC模型中Sma

13、d4表達(dá)的影響
　　在第12周肝纖維化期，免疫組化檢測(cè)顯示，DEN模型組肝組織內(nèi)Smad4表達(dá)較正常對(duì)照組顯著增加，低、中、高三個(gè)劑量CASE均可抑制DEN誘導(dǎo)的肝纖維化過程中Smad4表達(dá)；western blot檢測(cè)結(jié)果與免疫組化檢測(cè)結(jié)果基本一致，中、高劑量的CASE可顯著抑制DEN誘導(dǎo)的肝纖維化過程中的Smad4的表達(dá)。
　　在第16周肝癌期，免疫組化檢測(cè)顯示：與對(duì)照組比較，DEN模型組癌旁組織內(nèi)Smad4表達(dá)顯著增加

14、，而肝癌組織內(nèi)Smad4幾乎未見表達(dá)。低、中、高三個(gè)劑量CASE治療組肝組織Smad4蛋白表達(dá)與DEN模型組癌旁組織相比顯著降低，并呈劑量依賴性。western blot檢測(cè)結(jié)果與免疫組化檢測(cè)結(jié)果基本一致，顯示CASE可抑制DEN誘導(dǎo)肝癌過程中的Smad4蛋白的表達(dá)。
　　2. CASE對(duì)DEN誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化-HCC模型中PAI-1表達(dá)的影響
　　在第12周肝纖維化期和16周肝癌期，免疫組化和western blot均顯

15、示：DEN模型組PAI-1表達(dá)較正常對(duì)照組顯著增加，低、中、高三個(gè)劑量組CASE可明顯抑制DEN誘導(dǎo)的PAI-1表達(dá)。
　　3. CASE對(duì)DEN誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化-HCC模型中Smad7表達(dá)的影響
　　在第12周肝纖維化期和16周肝癌期，western blot顯示：DEN模型組Smad7表達(dá)較正常對(duì)照組顯著減少，低、中、高三個(gè)劑量組CASE可明顯上調(diào)Smad7表達(dá)。
　　4. CASE對(duì)DEN誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化-H

16、CC模型中Imp7和Imp8表達(dá)的影響
　　在第12周肝纖維化期，western blot顯示：DEN模型組Imp7和Imp8表達(dá)均較正常對(duì)照組顯著增加，低、中、高三個(gè)劑量組CASE可明顯抑制Imp7和Imp8表達(dá)。
　　在第16周肝癌期，western blot顯示：DEN模型組Imp7和Imp8表達(dá)均較正常對(duì)照組顯著增加，高劑量CASE可明顯抑制Imp7和Imp8表達(dá)，而低、中劑量CASE對(duì)Imp7和Imp8表達(dá)則無明顯

17、抑制作用。
　　5. CASE對(duì)DEN誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化-HCC模型中miR-145表達(dá)的影響
　　在第12周肝纖維化期，DEN模型組miR-145表達(dá)較正常對(duì)照組顯著增加。低、中、高三個(gè)劑量CASE治療組肝組織中miR-145表達(dá)較DEN模型組進(jìn)一步明顯增加。
　　在第16周肝癌期，DEN模型組miR-145表達(dá)較正常對(duì)照組顯著降低。中、高劑量CASE治療組miR-145表達(dá)較DEN模型組顯著上調(diào)，但仍顯著低于正常對(duì)

18、照組，而低劑量組miR-145表達(dá)未見明顯恢復(fù)。
　　6. CASE對(duì)DEN誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化-HCC模型中miR-21表達(dá)的影響
　　在第12周肝纖維化期，DEN模型組miR-21表達(dá)較正常對(duì)照組略低。低、中、高三個(gè)劑量CASE治療后，各劑量組miR-21表達(dá)均較DEN模型組顯著上調(diào)。
　　在第16周肝癌期，DEN模型組miR-21表達(dá)顯著低于正常對(duì)照組。低、中、高三個(gè)劑量CASE治療組肝組織中miR-21表達(dá)較DE

19、N模型組進(jìn)一步下調(diào)。
　　7. HepG2細(xì)胞中CASE對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的miR-145表達(dá)的影響
　　在HepG2細(xì)胞中，TGF-β1作用3h、6h和12h后miR-145表達(dá)顯著下調(diào)。20、40、80μg/ml CASE預(yù)處理24h，可恢復(fù)miR-145表達(dá)，較非CASE處理組顯著升高，以高劑量組效果最為明顯。
　　8. HepG2細(xì)胞中CASE對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的miR-21表達(dá)的影響
　　在HepG2細(xì)

20、胞中，TGF-β1作用3h、6h、12h和24h后miR-21表達(dá)顯著上調(diào)。20、40、80μg/ml CASE預(yù)處理24h，可抑制TGF-β1誘導(dǎo)的miR-21表達(dá)，miR-21表達(dá)水平較非CASE處理組顯著下降。
　　結(jié)論：
　　1.抑制PAI-1表達(dá)可能是CASE抗肝纖維化-HCC作用的重要機(jī)制，PAI-1或可成為藥物治療肝纖維化-HCC療效的判定指標(biāo)之一。
　　2.抑制Smad4蛋白表達(dá)，可能是CASE抗肝纖維