家族性開角型青光眼致病基因篩查與功能研究.pdf

1、目的青光眼是以進行性視神經變性和視野缺損為特征的一類綜合癥，位列全球第二位不可逆性致盲眼病。隨著我國人口結構老齡化，開角型青光眼的發(fā)病率逐漸增加，嚴重威脅患者視功能，對個人和社會均造成巨大損失。原發(fā)性開角型青光眼發(fā)病機制尚未闡明。目前普遍觀點認為原發(fā)性開角型青光眼為遺傳異質性疾病，遺傳因素在POAG的發(fā)病機制中起到關鍵作用。迄今為止已定位了6個POAG相關染色體位點，鑒定出兩個開角型青光眼相關致病基因：TIGR/MYOC(trabecl

2、uarmeshwork-inducibleglucocorticoidresponse)基因和OPTN基因(optineurin)。1999年葛堅教授課題組首先報道了一個典型、完整的原發(fā)性開角型青光眼大家系(GZ.1家系)。該家系具有家族聚集性、地域封閉性、遺傳穩(wěn)定性、臨床特征性等特點，具備青光眼分子遺傳學研究的獨特優(yōu)勢。 本研究應用全基因組掃描和基因測序法證實TIGR/MYOC基因為家族性開角型青光眼家系的致病基因，該家系中T

3、IGR/MYOC基因存在Pro370Leu和Arg169Gly兩種突變型，進一步本研究利用體內外基因轉染技術，對Pro370Leu和Arg169Gly突變型TIGR/MYOC基因進行體內外功能研究，試圖解讀TIGR/MYOC基因的致病機制，旨在通過揭示這一典型青光眼家系獨特表型背后的遺傳本質以及疾病發(fā)生、發(fā)展的過程，為原發(fā)性開角型青光眼發(fā)病機制的研究提供線索。 方法1.利用全基因組掃描、單倍體型分析以及基因測序方法對GZ.1家族

4、性開角型青光眼家系的致病基因進行定位篩查； 2.正常人眼小梁細胞的體外培養(yǎng)和鑒定：從角膜移植后剩余組織取材，利用組織塊培養(yǎng)法，進行小梁細胞體外培養(yǎng)，并利用光鏡、電鏡、細胞免疫組織化學法鑒定小梁細胞； 3.突變型TIGR/MYOC基因真核表達載體的構建：在野生型TIGR/MYOC基因真核表達載體的基礎上，利用定點突變技術，分別構建Arg169Gly和Pro370Leu突變型TIGR/MYOC基因真核表達載體； 4.

5、野生型以及突變型TIGR/MYOC基因真核表達載體體外轉染小梁細胞：利用脂質體轉染體外培養(yǎng)的小梁細胞，分別檢測野生型以及突變型TIGR/MYOC蛋白在細胞內外的表達量及其亞細胞器定位，細胞骨架蛋白-肌動蛋白和紐蛋白的形態(tài)與分布，小梁細胞遷移能力，內質網分子伴侶-PDI和GRP78、基質金屬蛋白酶的表達；并利用Hochest染色以及流式細胞儀檢測細胞凋亡情況； 5.野生型以及突變型TIGR/MYOC基因真核表達載體體內轉染：利用陽

6、離子聚合物(PEI)介導野生型以及突變型TIGR/MYOC基因體內轉染小梁網，分別于轉染后1d，3d，7d，14d進行小梁組織病理學切片、免疫組織化學、透射電子顯微鏡檢測小梁組織的結構改變。 結果1.經全基因組掃描、單倍體型分析以及基因測序方法證實，GZ.1家族性開角型青光眼家系的致病基因定位于1號染色體的TIGR/MYOC基因，TIGR/MYOC基因存在Pro370Leu和Arg169Gly兩種突變型； 2.體外成功培

7、養(yǎng)正常人眼小梁細胞，并獲得Pro370Leu和Arg169Gly突變型TIGR/MYOC基因真核表達載體； 3.經Westernblot分析檢測證實，培養(yǎng)上清液中突變型TIGR/MYOC蛋白的細胞外分泌較野生型明顯減少； 4.熒光免疫組化證實野生型TIGR/MYOC蛋白在小梁細胞內呈點狀、彌漫、散在分布；Argl69Gly突變型TIGR/MYOC蛋白的分布向核周集中，與內質網高度重疊;而Pro370Leu突變型TIGR/

8、MYOC蛋白是以大小不等、分布不均的積聚體形式存在于胞漿內； 6.RT-PCR以及westernblot分析結果顯示Arg169Gly突變型轉染組GRP78和PDI表達較對照組、野生型TIGR/MYOC基因轉染組輕度升高； 7.野生型以及突變型TIGR/MYOC基因對小梁細胞功能的影響 (1)突變型TIGR/MYOC基因轉染小梁細胞中微絲束粗大并向胞膜處邊集，紐蛋白在核周的分布明顯減少，而在胞膜處的分布則變得不連

9、續(xù)、不規(guī)則、呈散在點狀； (2)劃痕實驗結果顯示突變TIGR/MYOC基因轉染小梁細胞遷移率較野生型以及正常對照輕度下降，與細胞內肌動蛋白絲再分布及周邊部集聚相一致； (3)RT-PCR、western印跡雜交分析證實，Arg169Gly突變型TIGR基因轉染組MMP-2的表達明顯下降，但MMP-9的表達無明顯改變。 (4)Hotchest染色以及流式細胞檢測各組間凋亡細胞百分比無統(tǒng)計學差異。 8.野生型

10、以及突變型TIGR/MYOC基因體內轉染小梁網，小梁組織病理學切片未觀察到明顯異常，但透射電鏡觀察小梁組織發(fā)現(xiàn)小梁細胞出現(xiàn)內質網擴張、線粒體水腫、細胞凋亡、脫落。 結論1.GZ.1家族性開角型青光眼家系的致病基因為TIGR/MYOC基因; 2.TIGR/MYOC基因Pro370Leu突變?yōu)镚Z.1家族性開角型青光眼家系的致病性突變，可以作為一種檢測家系成員青光眼發(fā)病危險性的早期基因診斷手段； 3.Pro370Le

11、u和Arg169Gly突變型TIGR/MYOC蛋白的致病機制不同：發(fā)生于TIGR/MYOC蛋白N端的Arg169Gly突變型TIGR/MYOC蛋白在內質網內積聚，并可誘導內質網應激反應；而發(fā)生于TIGR/MYOC蛋白C端的Pro370Leu突變型TIGR/MYOC蛋白在細胞胞漿內以難以降解的積聚體形式存在； 4.GZ.1家族性開角型青光眼家系可能的發(fā)病機理為：Pro370Leu和Arg169Gly突變型TIGR/MYOC蛋白一級

12、結構的改變，使得蛋白質α-螺旋或β-折疊等二級結構的形成不能正確完成，最終導致蛋白質在內質網內錯誤折疊、功能構象發(fā)生嚴重錯誤，蛋白質無法正常分泌，在細胞內積聚，對小梁細胞造成毒性作用，小梁細胞功能異常，最終導致了GZ.1家系POAG的發(fā)生； 5.Pro370Leu可能屬于一種較為常見、古老的突變，與該家系早期發(fā)生、病情嚴重的臨床表型高度相關，對于GZ.1家系青光眼的發(fā)生起到關鍵的作用；6.Arg169Gly突變作為一種罕見變異為