LPLUNC1基因介導(dǎo)NFκB與MAPK信號傳導(dǎo)通路抑制鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展的機制研究.pdf

1、鼻咽癌(Nasopharyngealcarcinoma)是一種具有顯著種族和地域分布特點的上皮源性惡性腫瘤，好發(fā)于我國南方各省及東南亞地區(qū)，而在我國北方和歐美人中少見。其發(fā)病率在我國的南方各省約為25-50/100000，是西方國家的100倍。越來越多的研究表明鼻咽癌的病因與多種因素相關(guān)，包括病毒感染、遺傳因素和環(huán)境因素等。由于遺傳易感性(HLA單體型等)、EB病毒的感染及經(jīng)常暴露于眾多的致癌因素之下而導(dǎo)致新生細胞的無序生長，從而誘發(fā)鼻

2、咽癌。同時，調(diào)節(jié)細胞增殖、凋亡、細胞周期、基因組穩(wěn)定性及鼻咽細胞分化的關(guān)鍵基因由于遺傳因素(如基因擴增、缺失與突變)與外界因素(甲基化)而改變是鼻咽癌發(fā)生發(fā)展的重要原因。然而，鼻咽癌發(fā)病的分子基礎(chǔ)還遠未清楚。因此，更好的了解鼻咽癌發(fā)生的分子機制是更好的診斷、預(yù)防、治療鼻咽癌的基礎(chǔ)。 【LPS與鼻咽癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系】鼻咽是呼吸系統(tǒng)與消化系統(tǒng)的共同組成部分，無時無刻不暴露和接觸到共生微生物與病原微生物，機體依靠天然防御系統(tǒng)和抗原識別

3、的適應(yīng)性免疫反應(yīng)系統(tǒng)來進行自我保護。當機體整體或局部的防御機制受到破壞，病原微生物就會在機體局部產(chǎn)生炎癥，長期的慢性炎癥是病原微生物致腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵因素。慢性感染的重要毒力因素被認為是革蘭氏陰性細菌細胞壁的主要成分LPS，對LPS的識別與信號傳導(dǎo)是宿主細胞抵御革蘭氏陰性細菌的關(guān)鍵。我們應(yīng)用BrdU摻入實驗、MTT等實驗證實了LPS可促進鼻咽癌細胞系HNE1和5-8F細胞的生長與增殖。通過流式細胞、RT-PCR等研究還發(fā)現(xiàn)鼻咽癌細胞可與L

4、PS相結(jié)合且其受LPS調(diào)節(jié)的機制是由于鼻咽癌細胞中存在LPS受體分子如CD14、TLR4與MD2等的表達。同時應(yīng)用免疫熒光、western-blot、熒光素酶報告系統(tǒng)等研究發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌細胞(HNE1、5-8F)可受到LPS的誘導(dǎo)而活化NFκB與MAPK信號傳導(dǎo)通路。鼻咽癌細胞在LPS的誘導(dǎo)下，NFκBp65的表達增加，并且使NFκBp65活化遷移至核內(nèi)；同時在LPS的誘導(dǎo)下，鼻咽癌細胞MEK1、ERK1/2和JNK1/2表達增加，并且E

5、RK1/2和JNK1/2被激活而進入核內(nèi)。NFκB與MAPKs的過度活化是導(dǎo)致細胞增殖與惡性變的重要機制。同時我們研究還發(fā)現(xiàn)LPS增加TNF-α全長啟動子活性而對缺失了NFκB結(jié)合位點的TNF-α啟動子啟動子活性無明顯的改變，同時LPS可使鼻咽癌細胞中TNF-α的分泌增加，從而介導(dǎo)炎性因子的釋放。因此長期的慢性炎癥使NFκB與MAPK信號傳導(dǎo)通路過度活化，可導(dǎo)致鼻咽癌的發(fā)生，LPS介導(dǎo)的信號通路可能是鼻咽癌發(fā)生發(fā)展的重要分子機制之一。

6、 【LPLUNC1抑制LPS所介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)通路】LPLUNC1基因是我室采用聯(lián)合抑制性消減雜交和cDNAmicroarray技術(shù)分離鼻咽癌差異表達基因的方法克隆的鼻咽組織特異性表達新基因。我們以往的研究表明，該基因在71％的鼻咽癌患者中表達下調(diào)，而在正常的成人鼻咽組織及人胚鼻咽組織中為高表達，這些都提示LPLUNC1可能在鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展中起非常重要的作用。我們通過構(gòu)建LPLUNC1的真核表達載體，并將其穩(wěn)定轉(zhuǎn)染入5-8F、HN

7、E1鼻咽癌細胞系中，建立5-8F/pEGFP-C2-LPLUNC1與HNE1/pcDNA3.1(+)-LPLUNC1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：LPLUNC1可抑制LPS所誘導(dǎo)的鼻咽癌細胞增殖反應(yīng)。通過western-blot、免疫熒光等一系列的實驗證實，LPLUNC1可阻斷LPS所誘導(dǎo)的鼻咽癌上皮細胞NFκBp65、ERK1/2和JNK1/2的表達及活化。同時通過瞬時共轉(zhuǎn)染LPLUNC1與TNF-α熒光素酶報告系統(tǒng)證實LPLUNC1可抑

8、制TNF-α全長啟動子的活性，ELISA結(jié)果也證實了LPLUNC1可抑制鼻咽癌細胞受LPS刺激導(dǎo)致的TNF-α的產(chǎn)生，抑制炎性因子的釋放。因此，LPLUNC1可能通過阻斷LPS介導(dǎo)的NFκB與MAPK信號傳導(dǎo)通路而抑制鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展。 【LPLUNC1通過延緩細胞周期進程而抑制鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展】細胞周期進程是一個由眾多分子參與的嚴格調(diào)控的過程，失去對細胞周期正常的精細調(diào)控是大多數(shù)腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機制之一，因此，惡性腫瘤往往被

9、稱為細胞周期疾病。哺乳動物細胞周期通常由cyclin-CDK復(fù)合物所調(diào)控。我們通過對鼻咽癌細胞的細胞生物學(xué)研究進一步證實LPLUNC1可抑制鼻咽癌細胞生長與增殖，并使鼻咽癌細胞的集落形成減少并降低其裸鼠的成瘤性。經(jīng)流式細胞分析發(fā)現(xiàn)LPLUNC1可引起5-8F細胞周期分布發(fā)生明顯改變：G1期細胞明顯增加，S期細胞相應(yīng)減少，因此，LPLUNC1可延緩鼻咽癌細胞的細胞周期G1-S期進程。隨后，我們又應(yīng)用cDNA-microarray研究了LP

10、LUNC1的表達對鼻咽癌細胞系5-8F細胞基因表達譜的影響，結(jié)果篩選出了369個差異表達基因，其中有175個為下調(diào)基因，194個為表達上調(diào)基因，而這些差異表達基因中有19個基因與MAPK(如MAP4K5、MAP3K1和MAPK9等)及細胞周期(如E2F5、CDK7、CDK8、p27kip1等)密切相關(guān)，其結(jié)果部分通過western-blot證實，說明Microarray是可靠的。同時western-blot證實LPLUNC1可抑制MEK

11、1、ERK1/2、JNK1/2及下游c-MYC、c-JUN等的表達。且LPLUNC1可抑制MAPKs信號通路的活化。我們進一步通過western-blot、流式細胞分析和熒光素酶報告系統(tǒng)研究證實LPLUNC1可抑制cyclinD1、CDK4和CDK8的表達及RB的磷酸化，明顯下調(diào)cyclinD1及E2F3啟動子的活性，并抑制轉(zhuǎn)錄因子AP1的活性。因此，LPLUNC1可通過下調(diào)MAPKs信號傳導(dǎo)通路而抑制cyclinD1與CDK4的表達，

12、并降低E2F的活性，從而抑制細胞周期進程，參與調(diào)節(jié)鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展。 【BPI結(jié)構(gòu)域是參與調(diào)節(jié)鼻咽癌發(fā)生發(fā)展的LPLUNC1的重要功能域】LPLUNC1基因是屬于BPI/PLUNC基因超家族的新成員。生物信息學(xué)預(yù)測LPLUNC1蛋白含有2個BPI結(jié)構(gòu)域。BPI蛋白是一種分子量約55kD的陽離子分泌蛋白，具有結(jié)合脂多糖(LPS)，中和內(nèi)毒素和殺滅細菌作用，同時也是一種內(nèi)源性血管生成抑制劑并可抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移。其分子機制可能是BPI與

13、LBP競爭性地結(jié)合LPS，阻止LPS與LBP結(jié)合所啟動的信號傳導(dǎo)通路。因此，BPI結(jié)構(gòu)域可能是LPLUNC1重要的功能域。為了證實我們的科學(xué)假說，我們構(gòu)建了缺失BPI結(jié)構(gòu)域的LPLUNC1缺失突變體。研究發(fā)現(xiàn)，LPLUNC1全長定位于細胞漿，同時在細胞中可呈點狀聚集，而缺失BPI結(jié)構(gòu)域的LPLUNC1在細胞中不出現(xiàn)點狀聚集，且其分布可出現(xiàn)在胞漿或胞核中，說明BPI結(jié)構(gòu)域?qū)PLUNC1的亞細胞定位發(fā)揮了重要作用。同時我們還發(fā)現(xiàn)：BPI結(jié)

14、構(gòu)域的缺失導(dǎo)致了LPLUNC1抑制鼻咽癌細胞生長與增殖功能的喪失，其抑瘤性也喪失。缺失BPI結(jié)構(gòu)域的LPLUNC1對細胞周期的阻滯變得不明顯，對NFκB、TNF-α、E2F3、cyclinD1及AP1等信號通路分子的活性也沒有影響。由此可見，BPI結(jié)構(gòu)域是LPLUNC1的重要功能域。 因此，LPS所導(dǎo)致的慢性炎癥參與了鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展，而LPLUNC1基因通過其BPI結(jié)構(gòu)域阻斷LPS介導(dǎo)的NFκB與MAPK信號傳導(dǎo)通路而抑制鼻咽