B7-H3調(diào)節(jié)髓源性抑制細(xì)胞凋亡促進(jìn)小鼠前列腺癌進(jìn)展的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：本課題利用自行構(gòu)建的B7-H3高表達(dá)的小鼠前列腺癌RM-1（RM-1-B7-H3）及對(duì)照細(xì)胞株（RM-1-mock），通過(guò)體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)分析B7-H3在小鼠前列腺癌進(jìn)展中的免疫作用機(jī)制。
　　方法：檢索小鼠B7H3的核苷酸序列，合成小鼠B7H3基因片段，轉(zhuǎn)入目的載體，利用Gateway Technology構(gòu)建B7H3基因高表達(dá)的質(zhì)粒載體，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染獲得穩(wěn)定RM-1-B7-H3轉(zhuǎn)基因細(xì)胞以及RM-1-mock為對(duì)照細(xì)胞。應(yīng)用

2、熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白表達(dá)、RT-PCR檢測(cè)mRNA表達(dá)的變化以及流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測(cè)分析，鑒定RM-1-B7-H3轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的效率及穩(wěn)定性。在此基礎(chǔ)上，體外實(shí)驗(yàn)比較分析RM-1-B7-H3轉(zhuǎn)基因細(xì)胞以及RM-1-mock細(xì)胞增值能力；自C57BL/6小鼠皮下接種RM-1-B7-H3轉(zhuǎn)基因細(xì)胞以及 RM-1-mock細(xì)胞，觀察體內(nèi)成瘤情況；分離不同實(shí)驗(yàn)組荷瘤小鼠腫瘤組織及脾臟組織，流式分析技術(shù)檢測(cè)各組間 Gr-1+CD11b+M

3、DSC表達(dá)水平，并以PI評(píng)估MDSC凋亡情況；離體實(shí)驗(yàn)中，自健康C57BL/6小鼠脾臟分離純化Gr-1+CD11b+MDSC，并分別與RM-1-B7-H3轉(zhuǎn)基因細(xì)胞以及RM-1-mock細(xì)胞混合培養(yǎng)，以PI表達(dá)情況分析B7-H3對(duì)MDSC凋亡的影響；為進(jìn)一步確認(rèn)B7-H3對(duì)MDSC的凋亡作用，本論文同時(shí)采用siRNA技術(shù)干預(yù)髓源性細(xì)胞株THP-1上B7-H3表達(dá)構(gòu)建THP-1B7-H3low細(xì)胞以及THP-1-NC組，體外實(shí)驗(yàn)分析B7-

4、H3缺失對(duì)髓源性細(xì)胞凋亡的影響。此外，本論文還在利用環(huán)磷酰胺抑制C57BL/6骨髓增殖的基礎(chǔ)上，再次皮下移植接種RM-1-B7-H3轉(zhuǎn)基因細(xì)胞以及RM-1-mock細(xì)胞，觀察腫瘤生長(zhǎng)情況，分析B7-H3發(fā)揮促瘤作用是否依賴于髓源性細(xì)胞。
　　結(jié)果：成功構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)、高效表達(dá) B7-H3的 RM-1轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。體外實(shí)驗(yàn)RM-1-B7-H3轉(zhuǎn)基因細(xì)胞以及RM-1-mock細(xì)胞在增殖能力方面兩者并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；然而，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)RM-1

5、-B7-H3轉(zhuǎn)基因細(xì)胞腫瘤生長(zhǎng)顯著高于RM-1-mock細(xì)胞。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，荷瘤 RM-1-B7-H3的 C57BL/6小鼠腫瘤組織及脾臟組織中Gr-1+CD11b+MDSC細(xì)胞數(shù)量顯著高于RM-1-mock荷瘤小鼠；同時(shí)，本論文還發(fā)現(xiàn)RM-1-B7-H3荷瘤小鼠體內(nèi)MDSC凋亡率顯著低于RM-1-mock荷瘤小鼠。體外實(shí)驗(yàn)也證實(shí)RM-1-B7-H3細(xì)胞株與RM-1-mock細(xì)胞株相比，脾臟Gr-1+CD11b+MDSC凋亡率顯著下降

6、；人髓源性細(xì)胞株 THP-1-B7-H3low體外凋亡水平顯著高于THP-1-B7-H3high；上述結(jié)果提示B7-H3在抑制MDSC凋亡中發(fā)揮了重要作用。此外，環(huán)磷酰胺抑制骨髓造血后再次移植接種RM-1-B7-H3細(xì)胞株與RM-1-mock細(xì)胞株，構(gòu)建前列腺癌荷瘤小鼠模型，兩者之間的腫瘤生長(zhǎng)差異并不存在，提示 B7-H3促進(jìn)前列腺癌生長(zhǎng)依賴于髓源性細(xì)胞。
　　結(jié)論:眾多研究均證實(shí)B7-H3高表達(dá)與前列腺癌進(jìn)展密切相關(guān)，然而其中的