PIK3CA和AKT3基因多態(tài)性與家兔生長(zhǎng)速度關(guān)聯(lián)分析及對(duì)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖的影響.pdf

1、3-磷酸肌醇激酶(phosphoinositide3-kinase，PI3K)家族是眾多原癌基因中極重要的一員，參與多種信號(hào)通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞的主要生理功能。由PI3K與AKT組成的PI3K-AKT信號(hào)通路在細(xì)胞的增殖以及凋亡等過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。本試驗(yàn)采用PCR產(chǎn)物直接測(cè)序法尋找PIK3CA和AKT3基因的遺傳變異，應(yīng)用PCR-RFLP技術(shù)對(duì)歐洲大白兔、伊拉兔D系和福建黑兔3個(gè)肉兔品種共711個(gè)個(gè)體進(jìn)行基因型分析，探討家兔PIK3C

2、A和AKT3基因的多態(tài)性及其與家兔生長(zhǎng)速度的相關(guān)性。隨后選取出生后1d的新西蘭仔兔為實(shí)驗(yàn)材料，進(jìn)行分離、純化家兔骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞(Skeletal muscle satellite cells，SCs)，并采用siRNA介導(dǎo)的PIK3CA和AKT3基因進(jìn)行基因的沉默表達(dá)，研究其在家兔SCs增殖過程中發(fā)揮的作用。主要結(jié)果如下:
　　1.通過PCR產(chǎn)物直接測(cè)序，在PIK3CA基因序列上共找到6個(gè)SNPs位點(diǎn)，分別為: g.12178A＞

3、G、g.12388C＞T、 g.12605T＞C、g.12711C＞G、 c.3068A＞G和c.3377G＞C。其中c.3068A＞G為同義突變，位于外顯子20。對(duì)該位點(diǎn)采用PCR-RFLP的技術(shù)進(jìn)行基因分型并進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn):c.3068A＞G位點(diǎn)在歐洲大白和福建黑兔群體中，AG基因型個(gè)體的35、56和70日齡體重均顯著高于GG基因型個(gè)體(P＜0.05)，在伊拉兔D系群體中AG基因型個(gè)體35-70日齡的平均日增重則極顯著高于

4、GG基因型個(gè)體（P＜0.01）。
　　2.AKT3基因序列上檢測(cè)到2個(gè)SNPs位點(diǎn)，分別為:c.1213A＞C和g.258389T＞C。其中c.1213A＞C為同義突變，位于外顯子10。關(guān)聯(lián)性分析表明:c.1213A＞C位點(diǎn)在歐洲大白兔群體中，AA基因型個(gè)體的35、56和70日齡體重均顯著高于CC基因型個(gè)體（P＜0.05）。
　　3.針對(duì)PIK3CA和AKT3基因，分別采用三對(duì)特異的siRNA序列轉(zhuǎn)染SCs，然后qRT-PC

5、R法檢測(cè)在濃度分別為25nM、50nM、75nM和100nM情況下，轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組中PIK3CA和AKT3基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用50nM的si-PIK3CA-003和50nM的si-AKT3-001對(duì)細(xì)胞內(nèi)靶基因的mRNA表達(dá)水平均有理想的下調(diào)作用，對(duì)靶基因的抑制效率分別為85.16％和83.93％。
　　4.對(duì)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-PIK3CA-003或si-AKT3-00148h后，分別對(duì)靶基因和上下游

6、基因PTEN和FoxO1進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。結(jié)果表明:在轉(zhuǎn)染si-PIK3CA-003后，PIK3CA和AKT3基因的相對(duì)表達(dá)量均顯著下調(diào)， PTEN和FoxO1基因的表達(dá)量均顯著上調(diào);當(dāng)轉(zhuǎn)染了si-AKT3-001后， PTEN和FoxO1基因表達(dá)量均顯著上調(diào)。表明PTEN、FoxO1基因與PIK3CA、AKT3基因的相對(duì)表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)。
　　5.選取處于對(duì)數(shù)期的SCs進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，采用CCK-8試劑盒通過酶標(biāo)儀檢測(cè)其在轉(zhuǎn)染

7、si-PIK3CA-003或si-AKT3-001后細(xì)胞增殖能力的改變。結(jié)果發(fā)現(xiàn):轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)組OD值顯著低于空白對(duì)照組(P＜0.05)，說明通過轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)下調(diào)PIK3CA和AKT3基因表達(dá)后，細(xì)胞增殖能力均有顯著的下降。說明PIK3CA和AKT3在SCs的增殖過程中起到重要的作用，能夠正向調(diào)控肌細(xì)胞的增殖。
　　家兔PIK3CA和AKT3基因CDS區(qū)的SNPs與生長(zhǎng)速度相關(guān)，PIK3CA和AKT3基因可作為影響家兔生長(zhǎng)速度的重要候選基