產Il-9T細胞的體外誘導及Smad3-Smad4信號的作用.pdf

1、目的:
　　探討誘導初始型T細胞向產IL-9 T細胞分化的條件，建立體外誘導Th9細胞的方法;觀察在選定的誘導條件下細胞分化過程中可能發(fā)生的類型轉化，以及相關細胞因子、轉錄因子的變化和信號轉導途徑。
　　方法:
　　(1)MACS法分選初始型T細胞:無菌條件下，取6-8周齡雌性Balb/c小鼠脾臟，制成脾細胞懸液后通過磁珠分選出CD4+CD62L+初始型T細胞，經流式細胞儀分析其表面分子CD4以檢測分選效率。
　

2、　(2)產IL-9 T細胞的體外誘導和鑒定:分選得到的初始型T細胞用抗CD3和抗CD28激活，繼后分別用不同濃度的IL-4和TGF-β誘導分化，5天后在經PE標記的IL-9 McAb和Per-cy5.5標記的IL-4 McAb進行胞內雙色熒光染色，應用流式細胞儀分析不同濃度的IL-4和TGF-β對產IL-9 T細胞誘導的影響。
　　此外，分析不同誘導時間對產IL-9T細胞誘導的影響，即選擇不同濃度的IL-4和TGF-β，分別刺激初

3、始型T細胞不同時間，同樣用流式細胞技術分析誘導結果。
　　(3)qRT-PCR法檢測相關細胞因子和轉錄因子的mRNA表達水平:在本試驗確定的最佳IL-4、TGF-β濃度條件下，對初始T細胞以不同時間進行誘導分化。收集誘導的細胞，提取RNA，經逆轉錄后行qRT-PCR法，檢測IL-4、IL-9、PU.1、IRF-4和GATA-3等細胞因子和轉錄因子的表達水平。
　　(4)TGF-β信號通路重要分子Smad2、Smad3、Sma

4、d4等表達水平的測定:初始型T細胞相繼經抗CD3和抗CD28激活和經IL-4和TGF-β誘導不同時間后，收集細胞做qRT-PCR檢測，分析TGF-β信號通路重要分子Smad2、Smad3和Smad4的表達水平。
　　(5)統(tǒng)計學分析:通過GraphPad Prism5軟件對流式結果做出相應線性圖;應用GraphPad Prism5對定量結果做統(tǒng)計學分析，兩組間的均數(shù)比較首先進行組間的方差齊性分析(Levene' test)，方差齊

5、采用非配對t檢驗，方差不齊則采用非參數(shù)檢驗，以P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。
　　結果:
　　(1)30 ng/ml IL-4和5 ng/ml TGF-β作用5天，即為本研究確定的誘導產IL-9 T細胞的最佳條件。在初始型T細胞分化為產IL-9 T細胞的過程中，可見誘導5天時產IL-9T比例隨著IL-4濃度升高而增加，而利于產IL-9T細胞分化的TGF-β濃度以5 ng/ml為最佳，高或低于此濃度均不能有效地促進此類細胞的分化

6、。
　　(2)產IL-9 T細胞分化過程經歷IL-4+T細胞過渡階段。初始型T細胞在不同濃度IL-4(10 ng/ml、30 ng/ml)和TGF-β(2 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml)的培養(yǎng)條件下，于第3天首先分化為IL-4+T細胞，而第5天則分化為IL-9+T細胞。這一結果表明，在本研究采用的誘導條件下，Th9細胞的分化呈現(xiàn)從IL-4+T到IL-9+T分化的時序性。提示初始型T細胞分化為Th9細胞可能需要經歷T

7、h2細胞過渡階段，擬或Th2細胞也可直接誘導為IL-9+T或Th9細胞。
　　(3)qRT-PCR結果表明，在選定的最佳誘導條件下，初始型T細胞經誘導后于第3天和第5天時細胞因子IL-4和IL-9的表達水平與此時的細胞類型一致。在誘導的第5天和第3天相比，Pu.1(Sfpi1)表達有所下降而Irf4表達則升高，Gata3無明顯改變。
　　(4)TGF-β通路的信號分子Smad3和Smad4表達明顯上調。qRT-PCR分析結果

8、表明，初始型T細胞在30 ng/ml IL-4和5 ng/ml TGF-β刺激5天時，Smad3和Smad4的表達升高且明顯高于誘導的第3天，而Smad2的表達則無明顯改變。
　　結論:
　　體外，抗CD3和抗CD28預先激活的初始型T細胞，在IL-4(30 ng/ml)和TGF-β(5ng/ml)存在的條件下，經5天的時間可誘導出產IL-9T細胞;在誘導過程中經歷了IL-4+T細胞過渡階段，呈現(xiàn)從IL-4+T到IL-9+T