5-氮雜胞嘧啶核苷通過逆轉(zhuǎn)hepaCAM基因啟動子甲基化抑制膀胱癌細(xì)胞增殖.pdf

1、第一部分hepaCAM基因腺病毒載體構(gòu)建和鑒定
　　目的:構(gòu)建表達(dá)hepaCAM基因的重組腺病毒并在膀胱癌BIU-87細(xì)胞中鑒定。
　　方法:以pEGFP-N2-hepaCAM質(zhì)粒載體為模板，PCR擴增hepaCAM基因;將hepaCAM基因克隆到穿梭質(zhì)粒pAdtrack-CMV，構(gòu)建穿梭載體pAdtrack-CMV-hepaCAM;經(jīng)PmeI線性化后，在含pAdEasy-1的大腸桿菌BJ5183中進(jìn)行同源重組，篩選陽性克隆

2、;線性化后在HEK-293細(xì)胞中包裝、擴增，利用報告基因EGFP進(jìn)行病毒滴度檢測;實時熒光定量PCR，Western blot鑒定感染腺病毒的膀胱癌BIU-87細(xì)胞中hepaCAM基因的表達(dá)。
　　結(jié)果:測序、酶切驗證重組腺病毒載體pAdEasyI-hepaCAM構(gòu)建成功;病毒滴度可達(dá)1.6×1012;熒光定量PCR、Western blot均顯示感染hepaCAM腺病毒后膀胱癌BIU-87細(xì)胞中hepaCAM基因表達(dá)增高。

3、>　　結(jié)論:成功構(gòu)建hepaCAM腺病毒載體。
　　第二部分5-氮雜胞嘧啶核苷通過逆轉(zhuǎn)hepaCAM基因啟動子甲基化抑制膀胱癌細(xì)胞增殖
　　目的:探究去甲基化藥物5-氮雜胞嘧啶核苷（5-azacytidine，azac）對hepaCAM基因甲基化的影響以及對膀胱癌細(xì)胞增殖的影響。
　　方法:去甲基化藥物azac作用三株膀胱癌細(xì)胞（T24、EJ、BIU-87），MSP檢測hepaCAM基因的甲基化狀態(tài);RT-PCR檢測h

4、epaCAM和甲基轉(zhuǎn)移酶(dnmt3a/3b)的mRNA表達(dá)情況;Western blot和免疫熒光檢測hepaCAM和dnmt3a/3b蛋白的表達(dá)情況;流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分布情況、細(xì)胞克隆形成實驗、CCK-8實驗檢測細(xì)胞增殖情況。
　　結(jié)果:MSP顯示:膀胱癌細(xì)胞空白組hepaCAM基因存在高甲基化，而azac作用后逆轉(zhuǎn)了hepaCAM基因的高甲基化;RT-PCR和Wester-blot顯示:空白組，hepaCAM表達(dá)明顯下

5、調(diào)，而dnmt3a/3b表達(dá)明顯增多，azac作用后下調(diào)了dnmt3a/3b而上調(diào)了hepaCAM表達(dá);進(jìn)一步免疫熒光顯示，azac作用后dnmt3a/3b表達(dá)下調(diào)，結(jié)果同Western-blot一致;增殖相關(guān)實驗顯示:azac作用后G0/G1期細(xì)胞數(shù)量增多，與空白組相比有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)，且明顯抑制了細(xì)胞克隆的形成，抑制了細(xì)胞增殖的活力。
　　結(jié)論:膀胱癌細(xì)胞中，hepaCAM基因啟動子存在高甲基化，去甲基化藥物aza

6、c作用后下調(diào)了甲基化酶dnmt3a/3b表達(dá)，從而逆轉(zhuǎn)hepaCAM基因的高甲基化狀態(tài)，上調(diào)hepaCAM基因的表達(dá);并且去甲基化藥物作用后抑制了膀胱癌細(xì)胞的增殖。
　　第三部分5-氮雜胞嘧啶核苷對裸鼠膀胱癌細(xì)胞移植瘤的影響
　　目的:體內(nèi)研究5-氮雜胞嘧啶核苷對膀胱癌細(xì)胞裸鼠成瘤的影響。
　　方法:以膀胱癌EJ細(xì)胞在裸鼠皮下接種，形成膀胱癌皮下移植瘤;2周后，將老鼠隨機分為兩組，一組作為空白組(blank)，一組作為

7、藥物處理組(azac);空白組注射DMSO，藥物組注射去甲基化藥物azac;三周后處死老鼠，留取瘤體，切片行H&E及免疫組化染色，檢測hepaCAM和dnmt3a/3b表達(dá)情況。
　　結(jié)果:以3×106Ej細(xì)胞接種于裸鼠皮下成功成瘤，去甲基化藥物處理組腫瘤體積明顯小于空白組，有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05);免疫組化結(jié)果顯示，加藥組與空白組比較，hepaCAM表達(dá)升高，dnmt3a/3b表達(dá)降低。
　　結(jié)論:去甲基化藥物azac