攜帶小鼠Brcc3基因重組腺病毒的包裝及鑒定.pdf

1、目的:構(gòu)建能夠在體外真核細胞中過表達目標基因Brcc3的重組腺病毒真核表達載體，并進而使用HEK293細胞包裝重組腺病毒，從而為后續(xù)轉(zhuǎn)染小鼠心臟成纖維細胞（cFs）探討細胞內(nèi)Brcc3基因過表達對TGF-β信號通路各環(huán)節(jié)的影響做準備。
　　方法:
　　1、目的基因片段的擴增（擴增包括雙酶切位點的目標基因序列）
　　分別以Ndel-Sacl-Brcc3-F和Brcc3-R為上下游引物擴增Sacl-Brcc3;以Brcc3

2、-GST-F和Xhol-Spel-GST-R擴增 GST-Xhol及以 Ndel-Sacl-Brcc3-F和Xhol-Spel-GST-R擴增Sacl-Brcc3-GST-Xhol。
　　2、利用酶切連接構(gòu)建pDown-Brcc3/GST/IRES/EGFP并測序鑒定Sacl/Xhol雙酶切骨架載體pDown-MCS-IRES/EGFP和PCR回收產(chǎn)物Sacl-Brcc3-GST-Xhol，并將骨架片段pDown-MCS-IRES

3、/EGFP和目的基因Brcc3-GST連接，接著轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物到感受態(tài)細胞大腸桿菌stbl3，進行菌落PCR鑒定后挑取單克隆搖菌提取質(zhì)粒pDown-Brcc3/GST/IRES/EGFP送測序。
　　3、利用Gateway Technology構(gòu)建pAV.Ex1d-CMV＞Brcc3/GST/IRES/EGFPpDown-Brcc3/GST/IRES/EGFP和pAV.Des1d進行LR反應，將目標基因克隆到腺病毒載體pAV.Des

4、1d，于（反應產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到）大腸桿菌感受態(tài)細胞stbl3中進行（復制），PCR鑒定陽性克隆，挑單克隆搖菌提取質(zhì)粒送檢測序。
　　4、將重組腺病毒轉(zhuǎn)染293A細胞，進行病毒的包裝和擴增，并提取轉(zhuǎn)染的CFs細胞蛋白行Western blot檢測Brcc36蛋白表達水平。
　　主要結(jié)果:
　　1、經(jīng)瓊脂糖電泳鑒定表明目的片段Sacl-Brcc3-GST-Xhol擴增成功。
　　2、經(jīng)PCR檢測、瓊脂糖電泳及基因測序表明載

5、體pDown-Brcc3/GST/IRES/EGFP構(gòu)建成功。
　　3、經(jīng)PCR檢測、瓊脂糖電泳、基因測序及western blot分析表明重組腺病毒真核表達載體pAV.Exld-CMV＞Brcc3/GST/IRES/EGFP構(gòu)建成功。
　　主要結(jié)論:本研究利用Gateway技術成功構(gòu)建重組腺病毒真核表達載體pAV.Exld-CMV＞Brcc3/GST/IRES/EGFP，并成功包裝獲得過表達Brcc3基因的腺病毒。