林生地霉血液分離株致病性的動物實驗研究.pdf

1、目的：林生地霉(Geotrichum silvicola)為新近發(fā)現(xiàn)的一種罕見地霉，首次從巴西果蠅和印度柞蠶幼蟲身上分離出來[1]。2002年，我科從一例膿癬患兒的皮損中分離得到一株林生地霉，首次證實該菌可以感染人類[2]。2005年，我科又自一例中毒性表皮壞死松解癥患者的血液中分離出一株林生地霉，說明該菌亦可以引起系統(tǒng)性感染[3]。有關(guān)林生地霉的形態(tài)學、分子生物學、營養(yǎng)生理學等各方面均已作了詳細的研究[2～5]。研究發(fā)現(xiàn)林生地霉血液分

2、離株和皮損分離株在菌落形態(tài)與基因序列上略有差異。 本研究采用動物實驗的方法，將林生地霉血液分離株和皮損分離株分別接種于不同免疫狀態(tài)的昆明小鼠皮下、腹腔及靜脈，通過對實驗小鼠的死亡率、28天內(nèi)平均存活天數(shù)，心、肝、脾、肺、腎組織的真菌逆培養(yǎng)陽性率及各臟器真菌負荷量的檢測，一方面來探討機體免疫狀態(tài)和感染途徑對林生地霉血液分離株系統(tǒng)性感染的影響，另一方面來研究林生地霉血液分離株與皮損分離株在致病力方面有無差別。 方法：

3、 1.系統(tǒng)性林生地霉感染動物模型的制作將我科保存菌株活化后，接種于小鼠體內(nèi)使其感染，解剖小鼠分離出恢復(fù)毒力的菌株。分離出的菌株用無菌生理鹽水制成菌懸液，分別通過皮下、腹腔及靜脈接種于不同免疫狀態(tài)的昆明小鼠體內(nèi)。 2. 小鼠生存狀況及死亡情況的觀察連續(xù)觀察生存保護實驗各組小鼠接種后4周內(nèi)的生存狀況及死亡情況，并計算各組小鼠的死亡率及平均存活天數(shù)。 3. 各臟器大體改變將分期處死的小鼠解剖，無菌條件下取其心臟、肝臟、脾臟、肺

4、臟及腎臟，觀察各臟器是否腫大或萎縮、有無顏色改變及其表面有無膿性感染灶。 4. 組織真菌逆培養(yǎng)無菌條件下將各臟器研碎后分別接種于試管培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)，計數(shù)各組小鼠內(nèi)臟逆培養(yǎng)陽性數(shù)。培養(yǎng)陽性的菌落分別移種至平皿培養(yǎng)基及小培養(yǎng)的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，觀察其菌落形態(tài)以及菌絲和孢子的形態(tài)。 5. 臟器真菌負荷量測定無菌條件下取接種血液分離株小鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和接種皮損分離株小鼠的腎臟，勻漿后分別進行組織的真菌平皿培養(yǎng)，

5、計算各臟器的真菌負荷量。 6. 組織病理學檢查取接種血液分離株小鼠的心、肝、脾、肺、腎各臟器，用10％福爾馬林溶液固定，常規(guī)脫水、透明、包埋、切片，進行HE和PAS染色，光鏡下觀察其組織病理學改變。 結(jié)果： 1. 小鼠感染后的生存狀況免疫正常小鼠接種林生地霉后，其生活習性無明顯改變。皮下接種組小鼠背部接種部位出現(xiàn)一結(jié)節(jié)。免疫抑制腹腔組及免疫抑制靜脈組小鼠的進食量明顯減少，并逐漸消瘦。 2. 小鼠感染后的死

6、亡情況免疫抑制腹腔組及免疫抑制靜脈組在接種林生地霉后均有小鼠死亡，而其它組無死亡小鼠出現(xiàn)。接種血液分離株的免疫抑制腹腔組及免疫抑制靜脈組小鼠的死亡率及平均存活天數(shù)與其它組比較，均有顯著性差異(P<0.05)；而其它各組間比較均無顯著性差異(P>0.05)。在同一免疫狀態(tài)和接種途徑下，血液分離株與皮損分離株比較，其小鼠死亡率及平均存活天數(shù)均無顯著性差異(P>0.05)。 3. 各臟器大體改變小鼠解剖后，可見到不同程度呈紫紅色的肝脾

7、腫大及呈白色、粉色的肺臟萎縮。腹腔接種組個別小鼠臟器還可見粟粒大小膿腫。 4. 組織真菌逆培養(yǎng)小鼠內(nèi)臟組織培養(yǎng)3天后可見真菌生長，其菌落形態(tài)及鏡下形態(tài)均與接種的菌株相同。免疫抑制皮下組小鼠內(nèi)臟逆培養(yǎng)陽性率明顯低于免疫抑制腹腔組及免疫抑制靜脈組(P<0.05)，而后兩組比較其小鼠內(nèi)臟逆培養(yǎng)陽性率無顯著性差異(P>0.05)；在同一組內(nèi)，血液分離株與皮損分離株比較，無顯著性差異(P>0.05)。平皿培養(yǎng)菌落初為白色粉末狀，后逐漸變?yōu)?/p>

8、酵母樣，其邊緣可見呈放射狀的絨毛樣菌絲。小培養(yǎng)可見大量分支分隔的菌絲及矩形、桶形關(guān)節(jié)孢子和圓形孢子。 5. 臟器真菌負荷量接種血液分離株的各組小鼠腎臟真菌負荷量比較，有顯著性差異(P<0.05)；在小鼠免疫狀態(tài)及接種途徑相同的情況下，血液分離株與皮損分離株的小鼠。腎臟真菌負荷量無顯著性差異(P>0.05)。腹腔接種組及靜脈接種組小鼠脾臟真菌負荷量明顯高于其它臟器，差異有顯著性(P<0.05)。 6. 組織病理學檢查HE染

9、色可見組織細胞明顯變性、壞死和大量急性、慢性炎細胞浸潤，并可見組織細胞反應(yīng)性增生。PAS染色組織內(nèi)可見紫紅色的菌絲、關(guān)節(jié)孢子及圓形孢子。 結(jié)論： 1. 通過皮下、腹腔及靜脈接種林生地霉，均可致小鼠發(fā)生系統(tǒng)性感染。 2. 林生地霉血液分離株為一種條件致病性真菌，其致病力與機體免疫狀態(tài)密切相關(guān)。 3. 小鼠的感染程度與接種途徑相關(guān)，靜脈途徑較其它接種途徑感染程度重。 4. 無論何種接種途徑，脾臟均為林