肉食動物細(xì)小病毒流行株分子特征與致病性分析.pdf

1、肉食動物細(xì)小病毒屬于細(xì)小病毒科、原細(xì)小病毒屬成員，包括犬細(xì)小病毒（Canine parvovirus,CPV），貓細(xì)小病毒（Feline parvovirus,FPV）和水貂腸炎病毒（Mink enteritis virus,MEV）等。該病毒能感染貓科、犬科、鼬科、浣熊科及靈貓科等家養(yǎng)及野生多種動物發(fā)病，肉食動物細(xì)小病毒引起的疾病存在于世界各地，是危害上述肉食目動物的主要傳染病之一，每年都造成巨大的經(jīng)濟損失。CPV、FPV和MEV等肉

2、食動物細(xì)小病毒關(guān)系密切，本文從分子診斷學(xué)、流行病學(xué)、免疫原性及遺傳進化、轉(zhuǎn)錄組學(xué)等方面對我國肉食動物細(xì)小病毒進行了研究和探討。
　　首先建立了肉食動物細(xì)小病毒通用的納米PCR檢測方法，為我國肉食動物細(xì)小病毒流行病學(xué)調(diào)查提供了有效的手段。該方法敏感性可以檢測到8.75×101個拷貝的重組質(zhì)粒，是傳統(tǒng)PCR的100倍；特異性試驗表明本方法適合于CPV、FPV和MEV等肉食動物細(xì)小病毒的檢測，而與其他相關(guān)病毒均無交叉反應(yīng)性；臨床樣本檢測

3、表明本方法適用性良好，對于肉食動物細(xì)小病毒感染動物檢出率較高。
　　采用分子生物學(xué)方法對我國北方主要省市的CPV分子流行病學(xué)進行調(diào)查，對收集于2013~2016年間的221份CPV病料進行納米PCR初篩，克隆測序病毒的VP2基因和NS1基因，分析氨基酸位點突變情況，進行同源性比對及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建。結(jié)果表明我國CPV-2型、2a型、2b型和2c型共同流行，主要流行CPV-2a型，2014年以后北京和河北等地區(qū)開始出現(xiàn) CPV-2c型

4、；首次發(fā)現(xiàn)VP2上Ala5Gly新的突變，NS1上Val160Gly，Ala586Thr，Ala587Thr和Leu600Arg4個位點發(fā)生新的突變；完成了114株病毒VP2基因和49株病毒NS1基因序列測定。
　　進一步對我國流行的不同亞型的CPV進行分離鑒定，對CPV-2c型代表毒株進行免疫原性研究。結(jié)果表明，分別分離得到CPV-2型、2a型、2b型及2c型病毒2株、4株、5株和9株，鑒定表明分離毒株具有CPV典型特征，動物回

5、歸試驗表明試驗組比格犬呈現(xiàn)出細(xì)小病毒感染的典型癥狀，免疫原性試驗表明分離得到的CPV-2c型毒株能夠誘導(dǎo)比格犬產(chǎn)生中和抗體。序列分析表明分離的CPV-2a和CPV-2b型毒株都是Ser297Ala突變的新2a/2b型毒株，CPV-2c具有Ala5Gly突變的變異毒株，國內(nèi)首次分離鑒定2c型CPV。為研制不同亞型源CPV疫苗提供了基礎(chǔ)。
　　為了更好的了解我國MEV的流行情況，采用F81細(xì)胞從疑似患有腸炎的水貂糞便樣品中分離出2株病

6、毒，經(jīng)形態(tài)學(xué)、血清學(xué)、動物回歸試驗和分子生物學(xué)鑒定，分離的病毒為 MEV，分別命名為MEV/LN-10和SD12/01。對分離毒株VP2基因及其全基因組進行遺傳進化和基因重組分析表明，MEV/LN-10株病毒發(fā)生了自然重組，其主要與次要親本病毒分別是MEV-SDNH株和cpv/nj01/06株，首次發(fā)現(xiàn)CPV和MEV的自然重組現(xiàn)象，并且分離到重組毒株。
　　選取遺傳背景明確的MEVB株做為肉食動物細(xì)小病毒代表，利用RNA-Seq技

7、術(shù)分析F81細(xì)胞感染MEV前后宿主基因轉(zhuǎn)錄組的變化，共設(shè)感染0 h、3 h、6 h、12 h和24 h五組。結(jié)果表明在感染前后共篩選出614個差異基因，其中上調(diào)基因123個，下調(diào)基因491個；選取了14個差異基因進行了qRT-PCR驗證，結(jié)果表明測序差異顯著的組別與qRT-PCR驗證結(jié)果一致。功能分析表明這些差異基因與細(xì)胞增值和細(xì)胞周期、免疫反應(yīng)、腫瘤發(fā)生或抑制、細(xì)胞凋亡、信號通路、受體活性、分子傳感器活性等相關(guān)。本研究構(gòu)建了F81細(xì)胞