胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白-2參與斑馬魚胚胎心血管系統(tǒng)發(fā)育的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白(Insulin-like growth factor binding proteins,IGFBPs)是一組在生物進(jìn)化過(guò)程中高度保守的分泌蛋白家族,屬于胰島素樣生長(zhǎng)因子信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)超家族成員。IGFBPs通過(guò)調(diào)節(jié)循環(huán)中胰島素樣生長(zhǎng)因子的半衰期及其生物活性發(fā)揮其內(nèi)分泌調(diào)控作用。IGFBPs在胚胎期多種器官組織中高度表達(dá),提示其可能在胚胎發(fā)育的過(guò)程中扮演重要角色。已有研究證實(shí)IGFBPs在體外可以誘導(dǎo)促進(jìn)特定系細(xì)胞

2、株向成熟的心肌和血管內(nèi)皮細(xì)胞分化,IGFBP-4對(duì)于爪蟾胚胎的心臟發(fā)生具有正向調(diào)節(jié)作用。進(jìn)一步探索IGFBPs在胚胎心血管系統(tǒng)發(fā)育中的作用將有助于我們更好的理解人類出生缺陷特別是先天性心臟病的發(fā)病機(jī)理和分子機(jī)制,為更有效地預(yù)防控制疾病提供新的思路。
　　近年來(lái)斑馬魚已成為研究脊椎動(dòng)物胚胎早期發(fā)育,特別是心血管系統(tǒng)和心臟發(fā)生的理想模式動(dòng)物。首先,斑馬魚的基因表達(dá)圖譜已經(jīng)明確,心血管系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程與哺乳動(dòng)物比較存在高度的相似性;其次,斑

3、馬魚體外受精發(fā)育、早期通體透明,借助光學(xué)顯微鏡可以清楚實(shí)時(shí)地觀察到心臟的發(fā)育情況;最重要的是,由于可以通過(guò)滲透作用從外界環(huán)境中被動(dòng)獲取氧,因此即使其循環(huán)系統(tǒng)存在嚴(yán)重畸形的情況下也能夠存活較長(zhǎng)時(shí)間。上述原因使斑馬魚在胚胎心血管系統(tǒng)發(fā)育的研究中具備獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。
　　第一部分胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白-2在進(jìn)化中高度保守以及IGFBP-2基因在斑馬魚胚胎發(fā)育早期的時(shí)空表達(dá)譜
　　利用生物信息學(xué)方法證明生物進(jìn)化過(guò)程IGFBP-2基因及

4、蛋白的結(jié)構(gòu)和功能高度保守。利用反義RNA探針標(biāo)記的胚胎整體原位雜交技術(shù)分析IGFBP-2基因在斑馬魚胚胎發(fā)育早期的時(shí)空表達(dá)譜。IGFBP-2基因的雜交信號(hào)在野生型斑馬魚胚胎的雙側(cè)眼球、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(主要在中腦)和原始肝臟先后出現(xiàn),72hpf以后主要集中表達(dá)于胚胎肝臟,而發(fā)育早期在胚胎心血管局部并無(wú)表達(dá)。
　　第二部分建立IGFBP-2 MO基因表達(dá)下調(diào)的斑馬魚模型以及IGFBP-2下調(diào)后斑馬魚胚胎心臟發(fā)育的異常表型
　　設(shè)計(jì)

5、合成嗎啡啉修飾的反義寡核苷酸特異性抑制IGFBP-2基因的翻譯起始位點(diǎn),通過(guò)MO顯微注射技術(shù)建立斑馬魚胚胎IGFBP-2基因表達(dá)下調(diào)的模型。詳細(xì)觀察記錄48和72hpf野生型組、Con-MO組以及IGFBP-2 MO不同注射劑量組之間斑馬魚胚胎的發(fā)育情況和出現(xiàn)心臟異常表型的比例。0.25mmol/L MO注射組胚胎自24hpf起依次出現(xiàn)心率下降、心包水腫、心房擴(kuò)張、心室搏動(dòng)無(wú)力,房室環(huán)化障礙等心臟畸形,部分胚胎存在不同程度的循環(huán)瘀滯和瓣

6、膜反流。IGFBP-2 MO的注射劑量與胚胎心臟的異常表型存在劑量一效應(yīng)關(guān)系。接受IGFBP-2 MO與IGFBP-2 EGFP重組質(zhì)粒共注射的胚胎12hpf綠色熒光蛋白表達(dá)明顯減弱,而野生型和Con-MO組的熒光蛋白表達(dá)正常。該結(jié)果驗(yàn)證了IGFBP-2MO的有效性,即其能夠針對(duì)抑制斑馬魚胚胎內(nèi)源性IGFBP-2的基因表達(dá)。
　　第三部分 IGFBP-2 Mo基因下調(diào)對(duì)斑馬魚胚胎心臟發(fā)育標(biāo)志基因表達(dá)、外周血管發(fā)育以及對(duì)Vmhc-E

7、GFP轉(zhuǎn)基因魚心室特異綠色熒光蛋白表達(dá)的影響
　　既然IGFBP-2表達(dá)下調(diào)嚴(yán)重干擾斑馬魚胚胎的正常心臟發(fā)育,我們將進(jìn)一步研究其對(duì)斑馬魚胚胎心臟發(fā)育標(biāo)志基因的表達(dá)和外周血管發(fā)育的影響作用。胚胎原位雜交結(jié)果顯示心房特異性標(biāo)志基因Amhc的表達(dá)下調(diào);IGFBP-2基因下調(diào)的Vmhc-EGFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚48hpf心室特異性綠色熒光表達(dá)減弱；顯微熒光血管造影顯示IGFBP-2 MO組胚胎60hpf體節(jié)間血管顯影稀疏紊亂,提示IGFBP-