葉酸缺乏對斑馬魚心血管系統(tǒng)發(fā)育影響的實驗研究.pdf

1、葉酸在生物生長和發(fā)育過程中扮演重要的角色，它參與生物體內許多重要反應和重要物質的合成。人群中葉酸缺乏會導致胎兒許多先天性異常的發(fā)生率上升，(如先天性心臟病、神經管發(fā)育異常等)。目前許多模式生物應用于葉酸缺乏導致先天性發(fā)育異常的研究，在這些模式生物中同樣發(fā)現(xiàn)葉酸缺乏可導致心臟發(fā)育異常。但目前葉酸缺乏導致先天性發(fā)育異常的機制仍不明確。 1．葉酸缺乏斑馬魚模型的建立本實驗利用DHFR拮抗劑MTX和將DHFR基因knock-down的方

2、法構建葉酸缺乏的兩種斑馬魚模型。在我們采用化學遺傳學的方法即用葉酸拮抗劑MTX構建葉酸缺乏斑馬魚模型的實驗中，我們探尋了MTX影響斑馬魚心血管系統(tǒng)發(fā)育的特定濃度和特異性時段，并就MTX拮抗葉酸的機理進行了證實。我們還采用基因knock-down的方法，通過顯微注射嗎啡啉修飾的反義RNA來knock-down DHFR基因，阻斷葉酸生物學活性的發(fā)揮從而構建另一類葉酸缺乏斑馬魚模型。在實驗中我們通過上述兩種方法構建的葉酸缺乏斑馬魚模型的心血

3、管系統(tǒng)發(fā)育異常有相似性，都表現(xiàn)為心臟發(fā)育異常表型多樣、心功能受損、心臟流出道發(fā)育異常和血管發(fā)育受到干擾。斑馬魚葉酸缺乏模型的成功建立有助于我們進行后續(xù)葉酸缺乏導致先天性發(fā)育異常機理的研究。 2．葉酸缺乏對心血管發(fā)育相關基因表達的影響在第一部分構建的葉酸缺乏斑馬魚模型的基礎上，我們在此部分實驗中通過原位雜交或Q—PCR的方法檢測了葉酸缺乏對心臟發(fā)育相關基因 vmhc，amhc，hand2，mef2a，mef2c，bmp2b，nkx

4、2.5，has2，以及對血管發(fā)育相關基因flk-1，ephrinB2和ephB4表達的影響。并就hand2，mef2c，bmp2b,nkx2.5 和 has2 之間的相互作用關系進行了初步探討，以助于了解葉酸缺乏導致此五個基因表達下調的機理。我們還初步探討了葉酸缺乏對Hedgehog信號通路和Nodal信號通路的影響。 (1) 葉酸缺乏后部分心血管發(fā)育相關基因的表達減弱我們的實驗結果表明，葉酸缺乏對心臟發(fā)育相關基因vmhc,am

5、hc和mef2a的表達無影響，葉酸缺乏導致心臟發(fā)育相關基因hand2，mef2c，bmp2b,nkx2.5和has2 的表達減弱；葉酸缺乏對血管發(fā)育相關基因ephB4的表達無明顯影響，葉酸缺乏導致血管發(fā)育相關基因flk-1和ephrinB2的表達減弱。上述這些心血管發(fā)育相關基因的表達減弱可能是葉酸缺乏導致心臟發(fā)育異常的機理。 (2) hand2與mepc、bmp2b、nkx2.5和has2相互作用的初步研究在此部分實驗中我們發(fā)現(xiàn)

6、hand2、mef2c、bmp2b、has2和 nkx2.5之間存在著復雜的相互作用，在斑馬魚心臟發(fā)育過程中，meJ2c和bmp2b對hand2的表達有一定的調控作用，hand2可影響nkx2.5和has2的表達。葉酸缺乏可能影響了這些基因之間復雜的相互調控作用而導致心臟發(fā)育異常。 (3) 在斑馬魚心臟發(fā)育過程中dhfr與hand2相互作用的研究在本部分實驗中，我們發(fā)現(xiàn)在斑馬魚心臟發(fā)育過程中ahfr可調控hand2的表達。ahf

7、r knock-down后hand2的表達下調，是ahfr knock-down導致心臟發(fā)育異常的機理。hand2過表達可挽救ahfr knock-down導致的心臟發(fā)育異常表型，從而為葉酸缺乏導致心臟發(fā)育異常的基因治療提供線索。 3．葉酸缺乏對Hedgehog和Nodal信號通路的影響在此部分實驗中，我們檢測了葉酸缺乏對Hedgehog信號通路下游因子foxa2和ptc1以及對Nodal信號通路下游因子ntl和gsc表達的影響

8、，以探尋葉酸缺乏導致心臟發(fā)育異常和右側異位的可能機理。實驗結果表明，葉酸缺乏影響了Hedgehog信號通路的功能，但對Nodal信號通路影響不明顯。葉酸缺乏導致軸中胚層發(fā)育紊亂。 4．葉酸缺乏導致斑馬魚胚胎凋亡過度葉酸缺乏不僅只影響基因表達的水平，還可導致DNA雙鏈斷裂，造成細胞凋亡過度。在此部分實驗中，我們從檢測細胞凋亡水平即DNA斷裂方面入手對葉酸缺乏導致心臟發(fā)育異常的機理進行初步探討的結果表明，葉酸缺乏可以導致細胞DNA斷