胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白-4(IGFBP-4)基因的克隆、表達(dá)與蛋白純化.pdf

1、胰島素樣生長(zhǎng)因子(insulin-like growth factors，簡(jiǎn)稱IGFs)，又稱類胰島素樣生長(zhǎng)因子，是一類多功能細(xì)胞增殖調(diào)控因子。胰島素樣生長(zhǎng)因子系統(tǒng)由IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ、Ⅰ型和Ⅱ型胰島素樣生長(zhǎng)因子受體(insulin-like growth factor receptor，IGFR)以及與IGF特異性結(jié)合的胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白(insulin like growth factor binding protein，

2、IGFBP)家族組成，在正常細(xì)胞增生和惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中發(fā)揮重要作用。而胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白(IGFBP)是IGF的運(yùn)輸和儲(chǔ)存形式，IGF通常與結(jié)合蛋白一起產(chǎn)生和分泌，因而IGFBP對(duì)于調(diào)節(jié)游離IGF的濃度及其與受體的結(jié)合起著重要作用。 在已發(fā)現(xiàn)的10種胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白(IGFBP1-10)中IGFBP-4是分子量最小的，是一個(gè)細(xì)胞增殖抑制因子，最初是從人的成骨細(xì)胞的條件培養(yǎng)液中分離純化出來(lái)的，IGFBP-4主要作用有：

3、調(diào)節(jié)IGF的作用、在特定的細(xì)胞基質(zhì)中儲(chǔ)存IGF、不依賴IGF而發(fā)揮作用。 為了獲取大量的高純度的IGFBP-4、降低其生產(chǎn)成本、研究其蛋白功能和體內(nèi)IGFBP-4的調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。采用基因重組表達(dá)是獲得大量目的蛋白的主要途徑，本研究將用化學(xué)合成法合成IGFBP-4基因片段，通過(guò)PCR對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增，并構(gòu)建載體與該目的基因相連接，插入pGEX-6p-1融合蛋白表達(dá)載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX/-6p-1-IGFBP-4。經(jīng)轉(zhuǎn)化宿主

4、菌BL21，篩選高效率轉(zhuǎn)化子，搖瓶培養(yǎng)，將所構(gòu)建的IGFBP-4表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)IPTG(isopropyl-1-thio-beta-D-galactoside)誘導(dǎo)表達(dá)，收集細(xì)胞裂解、SDS-PAGE電泳檢測(cè)結(jié)果表明，IGFBP-4成功獲得表達(dá)。進(jìn)一步對(duì)誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)溫度和培養(yǎng)基pH值進(jìn)行優(yōu)化，通過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)確定了最適表達(dá)條件為16℃，pH9.5，20h，0.2mM IPTG，此條件下上清目的蛋白的表達(dá)總量最高，表明IGFBP-