食管癌細胞死亡受體5的表達與細胞周期的相關性分析.pdf

1、研究背景：
　　死亡受體5(Deathreceptor5，DR5)是腫瘤壞死因子凋亡誘導配體(TRAIL)的主要死亡受體之一，在TRAIL促進細胞凋亡的過程中發(fā)揮重要作用，是具有抗腫瘤應用前景的潛在的重要靶點之一。目前已有3種針對死亡受體5的靶向性抗腫瘤藥物正處于Ⅱ期臨床試驗之中。然而細胞表面的DR5表達量是影響及限制死亡受體5的靶向性抗腫瘤藥物作用的一個重要因素。由于DR5只有在細胞表面才能發(fā)揮作用，因此凡是促進細胞表面DR5表

2、達增加的因素均能提高細胞對TRAIL及抗DR5激動性抗體等藥物誘導細胞凋亡的敏感性。目前，眾多研究表明以DR5為靶點的抗腫瘤藥物與眾多化療藥物具有顯著的協同抗腫瘤作用，并降低了化療藥物的使用劑量及其應用所帶來的毒副作用。進一步探討表明這些化療藥物多數能夠影響細胞周期抑制細胞增殖，能有效增強細胞表達DR5。但是這些藥物是否通過細胞周期影響DR5表達，兩者之間即細胞周期與DR5表達是否具有密切聯系還不清楚。本課題的研究將明確細胞周期與DR5

3、表達的關聯性，這一研究結果將對抗腫瘤治療及以DR5為靶點的抗腫瘤藥物應用提供臨床指導，以及為闡明細胞周期影響DR5表達的分子機制提供理論指導，具有重要的理論和實際應用價值。同時本課題也純化出可溶性sDR5，并通過雜交瘤技術制備出DR5單克隆抗體，探索了關于DR5單克隆制備的技術條件。
　　目的:探究腫瘤細胞中細胞周期與DR5表達的相關性以及檢測DR5的表達和分布，并探索純化可溶性DR5蛋白(sDR5)和制備sDR5單克隆抗體的方法

4、，同時探索了所制備抗體的特異性。
　　方法:采用柱親和層析法純化sDR5;雜交瘤技術制備sDR5單克隆抗體;分子克隆技術轉染外源基因，用過量的Thymidin處理EC109，進行雙阻斷同步化法得到不同周期時相的細胞，流式細胞術檢測各個周期的DR5表達。免疫組化法、Westernblot免疫印跡法、免疫熒光法，流式細胞術，RT-PCR技術檢測各個周期DR5的表達和定位。采用攜帶目的基因DR5的pegfp-n2重組載體轉染食管鱗癌細胞

5、EC109中，觀察細胞處于鋪展或者非粘附狀態(tài)下的DR5表達分布和定位情況。
　　結果:純化出純度達到95％的sDR5蛋白;制備出活性良好的sDR5單克隆抗體;成功構建穩(wěn)定的帶有DR5的pegfp-n2的細胞株;細胞免疫組化和轉染重組載體pegfp-n2+DR5外源基因至EC109細胞中觀測DR5的表達，在鋪展狀態(tài)的細胞中，DR5主要分布在胞質和胞核周圍;而在非粘附狀態(tài)下，DR5主要分布在胞膜周圍，且DR5在胞質中呈聚集狀態(tài)。Thy

6、midin雙阻斷同步化釋放法，處理EC109細胞，分別在0h、3.5h、7.5h這三個不同時段獲得G1(90.04％)、S期(97.86％)、G2期(87.17％)這三個不同細胞周期時相的細胞;根據以上方法所獲得不同周期細胞來檢測DR5的表達結果:流式細胞術檢測EC109細胞不同細胞周期時相的DR5表達水平:normal組表達率為99.44％;G1期表達量為93.80％;S期的表達量為98.66％;G2期表達量為99.58％;免疫組化檢

7、測EC109細胞不同細胞周期時相的DR5表達（如圖13），DR5在不同細胞周期時相的表達量G0/G1期＜S期＜G2/M期;westernblot檢測不同細胞周期時相的DR5表達結果（如圖14），G1期低于S期，低于G2期，G2期表達最高;Realtime-PCR檢測在不同細胞周期時相的DR5表達量（如圖16），G0/G1和S期的DR5表達與G2/M期相比有統(tǒng)計學意義，有表達差異;我們采用2.5mMThymidine雙阻斷同步化法處理EC

8、109細胞，獲得G0/G1期細胞;采用10uMLJK-11和20nM秋水仙素處理EC109細胞24h，獲得G2/M期細胞，用一定濃度的具有促凋亡活性的抗DR5的抗體mDRA-6（本實驗室前期制備）分別處理正常EC109細胞、G0/G1期細胞、G2/M期細胞，AnnexinV和PI染色處理，流式細胞術檢測細胞凋亡（如圖17），G0/G1期與G2/M期相比，差異顯著，P＜0.05，有統(tǒng)計學意義。
　　結論:1、得到一株特異性良好以及活