小膠質(zhì)細(xì)胞對神經(jīng)損傷環(huán)境中MSCs生物學(xué)行為的影響及其信號傳導(dǎo)通路初探.pdf

1、神經(jīng)系統(tǒng)的損傷常常造成神經(jīng)元不可逆的死亡，由此引起的神經(jīng)功能喪失一直是困擾神經(jīng)病學(xué)家的難題。近來干細(xì)胞被應(yīng)用于神經(jīng)損傷后的組織修復(fù)與功能重建，為這一難題的解決提供了新的思路。研究表明MSCs(Marrowmesenchymalstemcells，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞)具有取材方便、容易分離獲取、適宜條件下可以跨胚層分化、移植免疫排斥弱等特點(diǎn)，成為神經(jīng)細(xì)胞移植治療研究中最活躍的領(lǐng)域，已經(jīng)在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中取得良好療效。在這一過程中，免疫系統(tǒng)處于何種

2、地位，其對干細(xì)胞移植后分化、增殖、神經(jīng)營養(yǎng)等生物學(xué)行為有何影響等問題尚無明確答案。小膠質(zhì)細(xì)胞被認(rèn)為是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最有代表性的免疫細(xì)胞，在不同環(huán)境下小膠質(zhì)細(xì)胞可以分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子或神經(jīng)毒性因子，對損傷神經(jīng)細(xì)胞的修復(fù)或死亡起直接的促進(jìn)作用，在腦缺血、帕金森氏病、阿爾茨海默病等多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變中發(fā)揮損傷和修復(fù)的雙重作用。本研究以小膠質(zhì)細(xì)胞為切入點(diǎn)，重點(diǎn)考察其在神經(jīng)損傷的微環(huán)境中對MSCs的增殖、分化、神經(jīng)營養(yǎng)等多種生物學(xué)行為的影響并對在

3、此環(huán)境下MSCs內(nèi)部的信號傳導(dǎo)通路進(jìn)行初步研究。 本研究通過實(shí)驗(yàn)得出如下結(jié)果： 1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定：MSCs原代培養(yǎng)第二天換液后，細(xì)胞呈圓形、發(fā)亮，散在貼壁分布，一周后呈纖維狀密集生長。在細(xì)胞覆蓋約80％培養(yǎng)瓶底時(shí)傳代，傳至第2-3代時(shí)應(yīng)用免疫熒光方法鑒定MSCs標(biāo)志抗原CD44，熒光鏡下見陽性細(xì)胞呈淡綠色熒光，在同一視野下觀察明視野下細(xì)胞生長，同熒光視野相比較，95％以上細(xì)胞為CD44陽性細(xì)胞。

4、PC12細(xì)胞株引進(jìn)后培養(yǎng)初期，呈成簇狀、多角形懸浮生長，傳代7-8代以上，部分細(xì)胞呈分化趨勢，表現(xiàn)為突起出現(xiàn)，并貼壁生長。BV2細(xì)胞株生長較迅速，細(xì)胞呈梭形、貼壁生長。 2、我們采用神經(jīng)元特異性烯醇化酶(Neuronspecificenolase，NSE)進(jìn)行免疫熒光染色以確定具有神經(jīng)元分化趨勢的細(xì)胞。熒光顯微鏡下見NSE陽性細(xì)胞體積較其它細(xì)胞略大，形態(tài)不一，多數(shù)有1-3個(gè)長突起，呈神經(jīng)元細(xì)胞的形態(tài)。其中，D組(與BV2共育并同

5、時(shí)接受受損PC12上清刺激的MSCs)及B組(僅接受受損PC12上清刺激的MSCs)可見相對其它組較明顯的NSE陽性細(xì)胞散在分布，而其他組中鏡下呈黑暗視野。計(jì)數(shù)全部各孔的NSE陽性細(xì)胞，經(jīng)MSCs增殖度標(biāo)準(zhǔn)化(NSE陽性細(xì)胞數(shù)/MTT)后比較各組NSE陽性細(xì)胞表達(dá)，D組為最高，同對照組相比有顯著差異(P＜0.05)。而B組次之，也較對照組顯著增高(P＜0.05)，但同D組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 3、MTT法檢測各組MSCs數(shù)量的結(jié)果

6、顯示：D組(受損PC12上清孵育及BV2共育組)MSCs數(shù)量最高，同對照組相比差異顯著(P＜0.05)，有BV2共育的C組、D組分別同無BV2共育的A組、B組相比，其MSC數(shù)量較后者增高，其中D組比B組顯著增高(P＜0.05)。 4、以MSCs上清孵育損傷PC1224小時(shí)后，檢測PC12的凋亡率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)各實(shí)驗(yàn)組之間PC12凋亡率出現(xiàn)顯著差別，以D組(受損PC12上清及與BV2共育的MSCs培養(yǎng)上清組)凋亡細(xì)胞數(shù)最少，同對照組相

7、比差異顯著(P＜0.05)，而B組(受損PC12上清處理的MSCs培養(yǎng)上清組)凋亡細(xì)胞數(shù)次之，但與對照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。D組凋亡細(xì)胞數(shù)明顯少于B組(P＜0.05)。 5、MSCs培養(yǎng)上清神經(jīng)營養(yǎng)因子檢測：僅TGF-β在各組中均能檢測到，而TGF-β在D組的表達(dá)同對照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。BD-NF、NGF在所有五組中均未達(dá)到檢測水平。 6、對MSCs細(xì)胞中磷酸化STAT3與總STAT3的檢測表明：D組ST

8、AT3的磷酸化激活程度同其它組相比有明顯差異(P＜0.05)，提示在有損傷神經(jīng)細(xì)胞及小膠質(zhì)細(xì)胞共同參與時(shí)，MSCs的生物學(xué)行為(如神經(jīng)營養(yǎng)、分化、增殖)啟動(dòng)或進(jìn)行過程中，有STAT3的活躍參與。經(jīng)磷酸化STAT3與MSCs增殖及分化的相關(guān)性檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，盡管二者的相關(guān)性均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但磷酸化STAT3同增殖的相關(guān)系數(shù)更高，有可能同增殖存在一定關(guān)系。 討論：免疫反應(yīng)在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中常有廣泛參與，又常常是神經(jīng)變性或神經(jīng)損傷的病理機(jī)制，

9、因而勢必對進(jìn)入神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)行營養(yǎng)或替代治療的干細(xì)胞產(chǎn)生重要的影響，如WongG等的研究就發(fā)現(xiàn)IFN可以促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的分化和神經(jīng)突起的生長。小膠質(zhì)細(xì)胞被認(rèn)為是由血液中單核細(xì)胞或多能單核前體細(xì)胞演變而來，是腦內(nèi)免疫功能的重要執(zhí)行者，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變時(shí)可以發(fā)揮損傷和修復(fù)的雙重作用。而關(guān)于其對干細(xì)胞分化增殖或神經(jīng)營養(yǎng)功能的影響尚未見報(bào)道。本研究以小膠質(zhì)細(xì)胞(BV2)為切入點(diǎn)，重點(diǎn)研究在神經(jīng)損傷的微環(huán)境下，小膠質(zhì)細(xì)胞對MSCs生物學(xué)行為的影響。

10、 BV2和PC12分別是小鼠的小膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞和嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞，二者已經(jīng)被廣泛用來替代小膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行研究。PC12經(jīng)老化Aβ1-40損傷后能分泌各種損傷相關(guān)的因子，而損傷PC12的上清與MSCs、BV2一起模擬構(gòu)成了腦內(nèi)神經(jīng)損傷的部分微環(huán)境。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：損傷PC12上清孵育的干細(xì)胞中NSE表達(dá)較正常PC12上清或?qū)φ战M增多，提示神經(jīng)細(xì)胞損傷后能通過其分泌的因子作用于干細(xì)胞，誘導(dǎo)干細(xì)胞向神經(jīng)元的分化。而正常PC12上清

11、孵育的MSCs的NSE表達(dá)與對照組相比沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示神經(jīng)細(xì)胞損傷是啟動(dòng)干細(xì)胞定向分化的必要條件。在BV2存在時(shí)，NSE陽性的干細(xì)胞在數(shù)量上多于未與BV2共育者，但在統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒有差異。說明小膠質(zhì)細(xì)胞至少對干細(xì)胞向神經(jīng)元細(xì)胞的分化沒有明顯的負(fù)面影響。在小膠質(zhì)細(xì)胞存在時(shí)(C組、D組)，不論孵育上清來自于損傷或正常的PC12，MSCs的增殖均高于無BV2共育組(A組、B組)，其中D組較B組有顯著提高(P＜0.05)，提示小膠質(zhì)細(xì)胞可以促進(jìn)

12、MSC增殖。以上提示受損神經(jīng)細(xì)胞的存在同分化的關(guān)系更密切，而小膠質(zhì)細(xì)胞主要影響了MSC的增殖行為。 我們又檢測了小膠質(zhì)細(xì)胞對干細(xì)胞在神經(jīng)損傷微環(huán)境中神經(jīng)營養(yǎng)功能或神經(jīng)毒性功能的影響。我們以MSCs分泌的上清孵育經(jīng)老化Aβ1-40損傷的PC12，再檢測損傷PC12的凋亡率，來考察MSC上清的神經(jīng)營養(yǎng)或神經(jīng)毒性水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在損傷PC12上清孵育下，與BV2共育的MSCs分泌的上清能顯著降低損傷PC12的凋亡，與對照組相比有顯著差

13、異(P＜0.05)。其他各組間PC12凋亡率沒有明顯差別。提示：BV2在神經(jīng)損傷環(huán)境中的存在能促進(jìn)MSCs的神經(jīng)營養(yǎng)功能，提高損傷神經(jīng)細(xì)胞的存活力，則BV2此時(shí)發(fā)揮著間接的神經(jīng)保護(hù)功能。我們又進(jìn)一步檢測了MSCs上清中神經(jīng)營養(yǎng)因子的存在，包括BDNF(Brainderivedneurotrophicfactors，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子)，TGF-β(轉(zhuǎn)化生長因子-β)，NGF(nervegrowthfactors，神經(jīng)生長因子)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)

14、：所有組均能檢測到TGF-β，而與BV2及損傷PC12上清共育的MSCs所分泌的上清中TGF-β分泌最高，與對照組相比有明顯差異(P＜0.05)，而BDNF、NGF在所有組中均未達(dá)到檢測水平。該結(jié)果提示：BV2有可能通過增加MSCs中TGF-β的分泌而促進(jìn)了MSCs的神經(jīng)營養(yǎng)功能。 MSCs在神經(jīng)損傷微環(huán)境下的生物學(xué)行為決定了它是否能挽救或替代損傷神經(jīng)細(xì)胞，而MSCs內(nèi)部信號的傳導(dǎo)是其生物學(xué)行為轉(zhuǎn)變的基礎(chǔ)。我們收集了MSCs的細(xì)

15、胞溶漿，對總STAT3及磷酸化STAT3進(jìn)行了檢測。結(jié)果表明：各組的總STAT3差異不大，而磷酸化STAT3在與損傷PC12上清及BV2共育的MSCs組有顯著提高(P＜0.05)，提示該組MSCs的各種生物學(xué)行為中有STAT3的活躍參與，盡管磷酸化STAT3與MSCs增殖及分化的相關(guān)性檢測的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義均不顯著，但磷酸化STAT3與MSCs增殖之間具有更高的相關(guān)系數(shù)，不排除在本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的微環(huán)境中，磷酸化STAT3同增殖的關(guān)系較分化更密切。

16、 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明小膠質(zhì)細(xì)胞能影響神經(jīng)損傷微環(huán)境中MSCs的生物學(xué)行為，使其向支持修復(fù)神經(jīng)損傷的方向轉(zhuǎn)變。而在此環(huán)境中，小膠質(zhì)細(xì)胞的行為有何變化，通過何種途徑影響MSCs的生物學(xué)行為尚未觸及，有待進(jìn)一步探討。 結(jié)論： 1、在神經(jīng)損傷環(huán)境下，小膠質(zhì)細(xì)胞的存在有利于MSCs增殖，并對向神經(jīng)元細(xì)胞的分化無負(fù)面影響。 2、神經(jīng)損傷微環(huán)境下，小膠質(zhì)細(xì)胞的存在能促進(jìn)MSCs的神經(jīng)營養(yǎng)功能，提高神經(jīng)營養(yǎng)因子的生成。