粘細(xì)菌分離方法探究.pdf

1、目前環(huán)境中超過99％的微生物仍然是不可培養(yǎng)的，這表明微生物資源潛力巨大。宏基因組測序技術(shù)的發(fā)展為我們提供了不依賴培養(yǎng)即可了解環(huán)境微生物的方法，但是基于培養(yǎng)的對微生物性狀以及生理生化特性的研究，仍然是傳統(tǒng)微生物分類依據(jù)，也是將豐富微生物資源運(yùn)用到生產(chǎn)實(shí)踐中必不可少的方法。
　　本文分析了目前關(guān)于新型微生物的分離方法，發(fā)現(xiàn)特定的分離方法只對環(huán)境中的特定微生物類群有效，換句話說，定向分離特定環(huán)境微生物要根據(jù)其特性設(shè)計(jì)針對性實(shí)驗(yàn)。就粘細(xì)菌

2、而言，除了具有分布廣、豐都高、代時(shí)長等特點(diǎn)外，還具有顯著的社會性，如生長的細(xì)胞密度依賴，群體運(yùn)動(dòng)，群體捕食等。鑒于粘細(xì)菌的這些特點(diǎn)，本文設(shè)計(jì)了微球包埋結(jié)合粘細(xì)菌助長的體系，嘗試對環(huán)境中未知粘細(xì)菌進(jìn)行分離篩選。
　　在本文的工作中，我們建立了低熔點(diǎn)瓊脂糖微球包埋的制備方法，得到直徑在50-70μm間的微球，并在微球中包埋單個(gè)細(xì)胞，包埋比例約為1∶10。然后我們將制得的含有單細(xì)胞微球接種于由粘細(xì)菌作為助長菌的助長體系中，通過粘細(xì)菌間的

3、相互促進(jìn)作用，使球內(nèi)的單細(xì)胞分裂為微菌落，再通過顯微操作技術(shù)，直接選取成功獲得微菌落的微球，進(jìn)行后續(xù)測序及培養(yǎng)。在進(jìn)行粘細(xì)菌間的包埋助長實(shí)驗(yàn)時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)粘細(xì)菌間的確存在生長的相互促進(jìn)作用，即被包埋的單個(gè)細(xì)胞在助長粘細(xì)菌的存在下可以分裂為菌落。這種促進(jìn)作用在親緣關(guān)系較近的粘細(xì)菌種群之間均可發(fā)生，且不依賴于接觸。在進(jìn)行土壤樣品的包埋助長實(shí)驗(yàn)時(shí)，我們獲得了約100株球內(nèi)微菌落，但測序結(jié)果沒有檢測到粘細(xì)菌，推測由于土壤環(huán)境存在許多快速生長菌，導(dǎo)

4、致生長緩慢的粘細(xì)菌在復(fù)雜環(huán)境中難以被發(fā)現(xiàn)。
　　為了定向富集環(huán)境中的粘細(xì)菌，本文采用較為先進(jìn)的拉曼技術(shù)嘗試對環(huán)境中疑似粘細(xì)菌的桿狀細(xì)胞進(jìn)行富集后，在運(yùn)用到包埋助長實(shí)驗(yàn)中。我們首先得到了6屬13株不同粘細(xì)菌的拉曼光譜，通過與其它類群微生物比較，發(fā)現(xiàn)于1150cm-1及1503cm-1處存在粘細(xì)菌特有的條帶，可以作為定向拉曼彈射環(huán)境疑似粘細(xì)菌的依據(jù)。我們共對約150個(gè)環(huán)境桿狀細(xì)胞進(jìn)行拉曼測試，得到10個(gè)含有1或2個(gè)特殊條帶的細(xì)胞，經(jīng)過