乳巖寧方誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡及抑制荷瘤裸鼠微血管生成作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：MCF-7是人源乳腺癌細(xì)胞，ER、PR、VEGF均陽(yáng)性表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)分為兩部分，通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)觀察乳巖寧方對(duì)MCF-7細(xì)胞凋亡的影響，通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)觀察乳巖寧方對(duì)MCF-7荷瘤裸鼠乳腺癌的抑瘤作用、抑制MCF-7荷瘤裸鼠腫瘤血管生成及對(duì)磷酸化Akt蛋白表達(dá)水平的影響，來(lái)探討乳巖寧方的作用機(jī)制，可能與PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)。
　　 材料與方法：實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株：MCF-7購(gòu)于湖南湘雅醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞庫(kù)（美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中

2、心ATCC制備）。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)小鼠（4-6周齡）50只雌雄各半，體重20±2 g；雌性BALB/c-nu/nu裸鼠（4-6周齡）30只，體重20±2 g購(gòu)于大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合證：SCXKGGD2004-0017。實(shí)驗(yàn)方法：一、含乳巖寧方SPF小鼠血清制備：50只SPF級(jí)小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3天，隨機(jī)分為對(duì)照組、用藥組，用藥組按人與小鼠體表面積比值折算成相當(dāng)于人臨床劑量10倍量給藥，對(duì)照組灌服等體積生理鹽水，于每天上、

3、下午相同時(shí)間（每次間隔12小時(shí)）灌胃，連續(xù)灌胃7天，后禁食不禁水，于未次給藥2次，中間間隔1h，于最后一次給藥后1小時(shí)，無(wú)菌操作下取血。血樣常溫放置4小時(shí)后4℃過(guò)夜，離心2000rpm×15min，0.22um微孔濾膜過(guò)濾分裝于EP管中，-20℃保存，使用前56℃水浴滅活30min。二、MTT比色法測(cè)定乳巖寧含藥血清對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的影響實(shí)驗(yàn)步驟:1將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以0.25％的消化胰酶/EDTA800ul消化，用10％FBS的D

4、MEM制成單細(xì)胞懸液；2調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105/ml，接種于3塊96孔板中，每孔200ul，于37℃，5％CO2飽和濕度條件培養(yǎng)24 h；3換用0.5％FBS的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)于37℃，5％CO2飽和濕度條件培養(yǎng)24 h，同步細(xì)胞于G0/G1期；4根據(jù)DMEM培養(yǎng)基中血清來(lái)源不同將細(xì)胞隨機(jī)分為6組，即5％正常血清組、10％正常血清組、20％正常血清組及相同體積分?jǐn)?shù)的5％中藥血清組、10％中藥血清組、20％中藥血清組，每組設(shè)10個(gè)復(fù)

5、孔；5每孔分別添加各組不同體積分?jǐn)?shù)血清及DMEM培養(yǎng)基，每孔終體積為200ul，繼續(xù)分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h；6在不同的終點(diǎn)時(shí)間均換成無(wú)血清DMEM100ul，并加入MTT（5mg/ml）20uL，孵育4 h后，吸棄培養(yǎng)液，然后加入二甲基亞砜（DMSO）150uL/孔，放于水平搖床輕微震蕩10 min；7用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（OD值），結(jié)果取均值；計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率=（對(duì)照組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD

6、值）/對(duì)照組OD值×100％。三、AO/EB熒光染色法觀察乳巖寧對(duì)MCF-7細(xì)胞凋亡的影響取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MCF-7細(xì)胞，PBS液沈滌1次，0.25％胰酶/EDTA800ul消化后，用含10％胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)液配成104個(gè)/ml的細(xì)胞懸液。以每孔2ml體積接種于6孔板，孔內(nèi)放玻片。細(xì)胞培養(yǎng)生長(zhǎng)抑制2天后，分為乳巖寧含藥血清濃度為5％、10％、20％、及對(duì)照組共4組，每組3個(gè)復(fù)孔，每組給藥24h。1天后，吸去培養(yǎng)液，取出6孔板的玻片

7、，PBS洗3次后，10％甲醛固定30分鐘，AO/EB染色，碳酸鹽緩沖甘油封片，熒光顯微鏡觀察，激發(fā)波長(zhǎng)為405 nm。每組分別計(jì)數(shù)3次，每次計(jì)數(shù)細(xì)胞300個(gè)，計(jì)算凋亡率，用SPSS10.0軟件X2檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，確定影響凋亡的含藥血清濃度。含藥血清濃度為20％組，凋亡率最高，因此以下實(shí)驗(yàn)選擇用20％濃度含藥血清進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。四、流式細(xì)胞儀檢測(cè)MCF-7細(xì)胞周期。五、乳巖寧對(duì)MCF-7細(xì)胞BAX/BCL2/Caspase3蛋白表達(dá)的影響取對(duì)

8、數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞，用0.25％胰酶/EDTA800ul消化后，配成104個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，以每瓶5ml體積接種于培養(yǎng)瓶中，每2天換液一次。在含有10％胎牛血清低糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待其生長(zhǎng)至70％融合時(shí)，換用0.5％FBS的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，同步細(xì)胞于G0/G1期。將細(xì)胞分為對(duì)照組（含20％空白血清）和中藥血清組（含20％中藥血清），培養(yǎng)24 h，1天后，倒去培養(yǎng)液。將細(xì)胞培養(yǎng)液吸棄，預(yù)冷PBS洗細(xì)胞2次，倒

9、出PBS，加入預(yù)冷的細(xì)胞裂解液，置冰上裂解細(xì)胞；細(xì)胞樣品完全破碎后，用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞，移至準(zhǔn)備好的1.5ml的EP管中。冷凍高速離心機(jī)中離心，4℃1500轉(zhuǎn)/min離心20分鐘，取上清，即是蛋白。用Western blot的方法進(jìn)行檢測(cè)。六、乳巖寧含藥血清誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制Westernblot檢測(cè)P-AKT蛋白表達(dá)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期平滑肌細(xì)胞，用PBS液洗滌1次，用0.25％胰酶/EDTA800ul消化后，制成單細(xì)胞懸液

10、，以每瓶5ml體積接種于培養(yǎng)瓶中，于37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)；待其生長(zhǎng)至70％融合時(shí)，換用0.5％FBS的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，同步細(xì)胞于G0/G1期；將細(xì)胞分為正常血清組（含20％空白血清）和中藥血清組（含20％中藥血清），培養(yǎng)24 h；在終點(diǎn)時(shí)間，更換含有PDGF-BB（5ng/ml）的培養(yǎng)基繼續(xù)孵育30min；分別于5min、10min、20min、30min將細(xì)胞培養(yǎng)基吸棄，細(xì)胞刮收集細(xì)胞，后續(xù)Western bl

11、ot檢測(cè)。七、以及MCF-7荷瘤裸鼠病理切片制備、透射電鏡觀察細(xì)胞凋亡微觀狀態(tài)、免疫組化檢測(cè)細(xì)胞凋亡原位雜交（TUNEL）法、MVD表達(dá)、ELISA方法檢測(cè)MCF-7荷瘤裸鼠血清中EGF/VEGF表達(dá)，以及Western blot法對(duì)PI3K-Akt蛋白檢測(cè)等。
　　 結(jié)果：
　　 1.MTT檢測(cè)提示乳巖寧20％含藥血清干預(yù)24小時(shí)對(duì)MCF-7有明顯抑制作用。流式細(xì)胞儀凋亡檢測(cè)試劑盒（AnnexinV-FITC）檢測(cè)提示

12、乳巖寧含藥血清可誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡。
　　 2.流式細(xì)胞儀細(xì)胞周期檢測(cè)提示乳巖寧含藥血清誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞停滯于G0/G1 S期，且呈量效關(guān)系。
　　 3.蛋白檢測(cè)乳巖寧含藥血清可下調(diào)BCL-2蛋白表達(dá)，提高Bax及Caspase3蛋白表達(dá)，降低Bcl-2/Bax比值，下調(diào)P-Akt表達(dá)，說(shuō)明乳巖寧含藥血清誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡機(jī)制之一是通過(guò)影響PI3K/Akt通路中磷酸化Akt蛋白表達(dá)水平，進(jìn)而干預(yù)細(xì)胞周期相關(guān)調(diào)控

13、蛋白的表達(dá)實(shí)現(xiàn)。
　　 4.MCF-7荷瘤裸鼠在體實(shí)驗(yàn)病理、電鏡形態(tài)學(xué)觀察細(xì)胞凋亡微觀狀態(tài)，免疫組化檢測(cè)細(xì)胞凋亡原位雜交（TUNEL）法、蛋白檢測(cè)P-Akt弱表達(dá)，印證乳巖寧方對(duì)MCF-7荷瘤裸鼠亦具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用。
　　 5.乳巖寧方分組干預(yù)后免疫組化檢測(cè)MCF-7荷瘤裸鼠MVD下降、ELISA方法檢測(cè)MCF-7荷瘤裸鼠血清中EGF/VEGF表達(dá)下調(diào)，說(shuō)明乳巖寧方具有抑制乳腺癌血管生成作用，對(duì)MCF-7荷瘤裸鼠乳腺